Summary

En metode til at teste effekten af ​​miljøvinkler på parringsadfærd i<em> Drosophila melanogaster</em

Published: July 17, 2017
doi:

Summary

Vi demonstrerer en analyse for at analysere de miljømæssige og genetiske signaler, der påvirker parringsadfærd i frugtfly Drosophila melanogaster .

Abstract

En persons seksuelle drev påvirkes af genotype, erfaring og miljøforhold. Hvordan disse faktorer interagerer med at modulere seksuel adfærd forbliver dårligt forstået. I Drosophila melanogaster påvirker miljømæssige signaler, såsom fødevaretilgængelighed, parringsaktivitet, der tilbyder et traktabelt system til at undersøge mekanismerne, der modulerer seksuel adfærd. I D. melanogaster registreres miljømærker ofte via kemosensoriske gustatoriske og olfaktoriske systemer. Her præsenterer vi en metode til at teste virkningen af ​​miljømæssige kemiske tegn på parringsadfærd. Assayet består af en lille parringsarena indeholdende madmedium og parringpar. Parringsfrekvensen for hvert par overvåges kontinuerligt i 24 timer. Her præsenterer vi anvendeligheden af ​​dette assay for at teste miljøforbindelser fra en ekstern kilde gennem et trykluftsystem samt manipulering af miljøkomponenterne direkte i parringsarenaen. Den uSe et trykluftsystem er især nyttigt til at teste virkningen af ​​meget flygtige forbindelser, mens manipulering af komponenter direkte i parringsarenaen kan være af værdi for at fastslå en forbindelses tilstedeværelse. Dette assay kan tilpasses til at svare på spørgsmål om indflydelse af genetiske og miljømæssige tegn på parringsadfærd og fecundity samt andre reproduktive adfærd hos mænd og kvinder.

Introduction

Reproduktiv adfærd har typisk høje energikostnader, især for kvinder, der producerer større gameter end mænd og skal omhyggeligt vælge vilkårene for at hæve deres udviklende afkom. På grund af energikostnaden er det ikke overraskende, at reproduktion er forbundet med ernæringsmæssige forhold. Dette gælder i de fleste, om ikke alle, dyr, herunder pattedyr, hvis pubertet kan forsinkes af underernæring, og hvis seksuelle drev kan blive negativt påvirket af fødevarebegrænsning 1 .

Reproduktionen af ​​den genetiske modelorganisme Drosophila melanogaster påvirkes også af næringsbetingelser. Haner domstol på højere niveau i nærværelse af fødevarer flygtige 2 , og kvinder er mere seksuelt modtagelige i nærværelse af gær, et vigtigt næringsstof til ægproduktion og afkom overlevelse 3 , 4 , 5 . Det herEvolutionært konserveret reproduktivt respons på mad giver mulighed for at studere mekanismer, der forbinder miljøtilgængeligheden til seksuel reproduktion i en genetisk tålelig og tidseffektiv organisme. Faktisk har arbejdet i D. melanogaster impliceret insulinvejen som en vigtig regulator for forbindelsen mellem mad og parringsadfærd 6 . Det har også vist, at handlingen med parring selv ændrer kvindens madpræference såvel som de tilhørende kemosensoriske neuroner 7 , 8 , 9 .

Det er klart, at fødevaresignaler påvirker reproduktive adfærd i D. melanogaster . Disse virkninger synes primært at påvirke kvinder, især dem, der allerede har parret 5 . For at teste disse akutte virkninger af miljømæssige forhold kan analysen klassisk anvendt til kvindelig parringsadfærd dogIkke meget passende på grund af de lange afbrydelser mellem parringspisoder. I den klassiske remitterende analyse mødes en jomfru kvinde først med en mand, og isoleres straks og præsenteres med en ny mand 24 til 48 timer senere. Dette klassiske assay er blevet anvendt med stor succes til at identificere komponenter af det mandlige ejakulat, der ændrer den kvindelige opførsel og kvindespørgsmålet 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . Den kontinuerlige parringsanalyse demonstreret her er derfor en tilføjelse til klassiske parringsanalyser, der kan anvendes til at studere den akutte virkning af miljømæssige forhold på reproduktionsadfærd.

Ved hjælp af det kontinuerlige assay for parringsadfærd, der forklares her, viste vi tidligere, at et par fluer udsat for gær vil remate sEveral gange over en 24 timers observationsperiode 5 , 19 , 20 , 21 , mens fluer ikke udsættes for mad, vil kun remate en gang 5 . Denne opdagelse kan være uoverskuelig i lyset af en stor del af D. melanogaster litteraturen, der tyder på, at kvinder ikke remitterer i flere dage efter en indledende parring (gennemgået i henvisninger 10 , 11 ). Denne uoverensstemmelse kan dog let forklares ved analysevilkår, hvor en kvinde er isoleret i en til flere dage, før der gives en ny parring mulighed. Hvis parret ikke parrer i denne times lange observationsperiode, er kvinden karakteriseret som ikke modtagelig. Desuden bør den høje parringsfrekvens ikke være overraskende, da dataene fra vildefangne ​​fluer viser, at kvinder indeholder sæd fra 4 til 6 mænd i deres opbevaringsorganer; Således iDicere, at kvinder normalt afholder flere gange 22 , 23 .

Her demonstrerer vi brugen af ​​denne kontinuerlige parringsanalyse for at ophæve, hvordan fluer samler og kombinerer information om miljøforhold for at modulere parringsfrekvens. Dette assay gør det muligt for en at teste et relativt stort antal parringspar til genetiske undersøgelser og for at teste indflydelsen af ​​flygtige og ikke-flygtige miljøindikatorer. Assayet løber typisk i 24 timer, men kan forlænges til 48 timer, hvilket muliggør afprøvning af cykliske miljøindikatorer, såsom den lysmørke (LD) cyklus. Vi demonstrerer denne analyse ved at teste indflydelsen af ​​flygtige signaler fra en gærkultur i et trykluftsystem i kombination med tilgængeligheden af ​​ikke-flygtigt gærnæringsstof i fødevaresubstratet.

Trykluftsystemet pumper kontinuerligt flygtige signaler ind i en parringsarena, der indeholderEt fødevaresubstrat og et testpar (hvis parringsadfærd overvåges). For yderligere at bestemme de særlige forhold, hvorigennem gær påvirker parring, tester vi en større flygtig forbindelse af gær, nemlig eddikesyre 24 , i kombination med et aminosyreindhold, der svarer til gærets i fødevaresubstratet i form af pepton (amino Syrer afledt af enzymatisk fordøjelse af animalske proteiner). Sammen viser disse eksperimenter, hvordan effekten af ​​miljøindikatorer på D. melanogasters parringsadfærd kan testes med dette assay.

Protocol

1. Miljøstyret parringsboks For at sikre et kontrolleret og let at rengøre testområde skal du oprette et køkkenskab af rustfrit stål på 120 cm x 64 cm x 85 cm som vist i figur 1A. Bor et hul bag på kabinettet lige under loftet og fire sæt med fire huller i siderne, hver med en diameter på 2 cm. Bor de to første sæt med fire huller på hver side af kassen i en højde på 7 cm fra bunden af ​​kassen og med 12,5 cm mellem hullerne. Bor de to andre sæt på hver side af ka…

Representative Results

Ved anvendelse af denne kontinuerlige analyse, parringsadfærd og parringsfrekvens i specifikke kan bestemmes under eksperimentelle miljøforhold. For at styre miljøforholdene forvandlede vi et køkkenskab af rustfrit stål til et testområde med egen lyskilde og diffusion, hvilket sikrer en høj overflod af lys og et minimum af blænding fra toppen af ​​parringsarenaerne ( Figur 1A ) . Det indre testområde er helt indkapslet af rustfrit stål og glas, hvilket gør…

Discussion

Denne protokol beskriver et test for at teste parringsadfærd i løbet af 24 timer, mens du løbende styrer de miljømæssige signaler, som et parretpar er hypotetiseret til at bruge til at bestemme parringsfrekvensen. Det er muligt at øge parringsfrekvensen som reaktion på gærluft leveret gennem et trykluftsystem, når mediet også indeholder gær ( figur 2B ). Derudover kan et lignende svar i parringsfrekvens observeres med et forenklet fødevaremedium indeholdende kun agar-, pepton- og eddikesyrel…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi takker Bloomington Drosophila Stock Center for flybestandene; C. Gahr, JT Alkema og S. van Hasselt for deres tidlige forsøg på at udvikle trykluftanalysen; Jasper Bosman for råd om dyrkning af gær Og Rezza Azanchi og Joel Levine for oprindeligt at udvikle time-lapse overvågningen af Drosophila parringsadfærd. JA Gorter blev støttet af et stipendium fra Neuroscience Research School BCN / NWO Graduate Program. Dette arbejde blev delvist støttet af den nederlandske organisation for videnskabelig forskning (NWO) (reference: 821.02.020) til JC Billeter.

Materials

Cabinet
Stainless steel kitchen cabinet Horecaworld 7412.0105
White LEDs Lucky Light ll-583wc2c-001 Cold white, 20 mAmp and 2 V
Red LEDs Lucky Ligt ll-583vc2c-v1-4da Wavelength between 625 nm, 20 mAmp and 6 V
Resistor Royal Ohm CFR0W4J0561A50 560 ohm, 0.25 W, 250 V and 5 % tolerance
Smartphone light meter app Patrick Giudicelli Light/Lux Meter FREE, version 1.1.1
Power timer Alecto TS-121
Metal brackets Sharp angle 5 by 5 mm,  2 x 5450 and 1 x 1100 mm long
Frosted glass plate 1190 x 545 x 5 mm
Filter paper sheets LEE filters 220 White frost
Small fan Nanoxia Deep silence 4260285292828 80 mm Ultra-Quiet PC Fan, 1200 RPM
Big fan Nanoxia Deep silence 4260285292910 120 mm Ultra-Quiet PC Fan, 650-1500 RPM
Webcam camera Logitech 950270 B910 HD WEBCAM OEM, Angle: 78-degree, resolution: 5-million-pixel  
Camera software DeskShare Security monitor pro
Name Company Catalog Number Comments
Fly rearing
Fly rearing bottles Flystuff 32-130 6oz Drosophila stock bottle
Flypad Flystuff 59-114
Wild-type flies Canton-S
Fly rearing vials Dominique Dutscher 789008 Drosophila tubes narrow 25×95 mm
Incubator Sanyo MIR-154
Magnetic hot plate Heidolph 505-20000-00 MR Hei-Standard
Agar Caldic Ingredients B.V. 010001.26.0
Glucose Gezond&wel 1019155 Dextrose/Druivensuiker
Sucrose Van Gilse Granulated sugar
Cornmeal Flystuff 62-100
Wheat germ Gezond&wel 1017683
Soy flour Flystuff 62-115
Molasses Flystuff 62-117
Active dry yeast Red Star
Tegosept Flystuff 20-258 100%
Peptone (bacto) BD 211677
Acetic Acid Merck 1000631000 Glacial, 100%
Small petridish Greiner bio-one 627102 35 x 10 mm with vents
Paraffin film Bemis NA Parafilm
Name Company Catalog Number Comments
Yeast and pressurised air set-up
Big petridish Gosselin BP140-01 140 x 20.6 mm
Ultrapure water Millipore corporation MiliQ
Yeast extract BD 212750
Agar (pure) BD 214530 bacto
Glucose (0(+)-glucose monohydrate)  Merck 18270000004
Open caps Schott 29 240 28  GL45
Silicone septum VWR 548-0662
Barbed bulkhead fittings Nalgene 6149-0002
Large PVC tubing diameter: outer 1.2 cm and inner 0.9 cm
Small PVC tubing diameters: outer 0.8 cm and inner 0.5 cm
15 ml tube Falcon
Aquarium pump Sera precision Sera air 110 plus, AC 220-240 V, 50/60 Hz, 3 W and pressure >100 mbar
Activated charcoal Superfish A8040400 Norit activated carbon
Disposible filter unit Whatman 10462100
Serological pipettes VWR 612-1600
Syringe BD Plastipak 300013
Hot glue Pattex
Syringe filter Whatman FP 30/pore size 0.45 mm CA-S
Name Company Catalog Number Comments
Analysis
Statistics software R lme4 package

Referencias

  1. Hileman, S. M., Pierroz, D. D., Flier, J. S. Leptin nutrition, and reproduction: timing is everything. J. Clin. Endocrinol. Metab. 85 (2), 804-807 (2000).
  2. Grosjean, Y., et al. An olfactory receptor for food-derived odours promotes male courtship in Drosophila. Nature. 478 (7368), 236-240 (2011).
  3. Harshman, L. G., Hoffman, A. A., Prout, T. Environmental effects on remating in Drosophila melanogaster. Evolution. 42 (2), 312-321 (1988).
  4. Fricke, C., Bretman, A., Chapman, T. Female nutritional status determines the magnitude and sign of responses to a male ejaculate signal in Drosophila melanogaster. J. Evol. Biol. 23 (1), 157-165 (2010).
  5. Gorter, J. A., Jagadeesh, S., Gahr, C., Boonekamp, J. J., Levine, J. D., Billeter, J. -. C. The nutritional and hedonic value of food modulate sexual receptivity in Drosophila melanogaster females. Sci. Rep. , 1-10 (2016).
  6. Wigby, S., et al. Insulin signalling regulates remating in female Drosophila. Proc. Biol. Sci. 278 (1704), 424-431 (2011).
  7. Ribeiro, C. The dilemmas of the gourmet fly: the molecular and neuronal mechanisms of feeding and nutrient decision making in Drosophila. Front. Neurosci. 7, 1-13 (2013).
  8. Walker, S. J., Corrales-Carvajal, V. M., Ribeiro, C. Postmating circuitry modulates salt taste processing to increase reproductive output in Drosophila. Curr. Biol. 25 (20), 2621-2630 (2015).
  9. Hussain, A., Üçpunar, H. K., Zhang, M., Loschek, L. F., Grunwald Kadow, I. C. Neuropeptides modulate female chemosensory processing upon mating in Drosophila. PLoS Biol. 14 (5), e1002455-e1002428 (2016).
  10. Avila, F. W., Sirot, L. K., LaFlamme, B. A., Rubinstein, C. D., Wolfner, M. F. Insect seminal fluid proteins: identification and function. Annu. Rev. Entomol. 56 (1), 21-40 (2011).
  11. Laturney, M., Billeter, J. C. Neurogenetics of female reproductive behaviors in Drosophila melanogaster. BS:ADGEN. 85, 1-108 (2014).
  12. Liu, H., Kubli, E. Sex-peptide is the molecular basis of the sperm effect in Drosophila melanogaster. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 100 (17), 9929-9933 (2003).
  13. Ram, K. R., Wolfner, M. F. Sustained post-mating response in Drosophila melanogaster requires multiple seminal fluid Proteins. PLoS gen. 3 (12), 2428-2438 (2007).
  14. Yapici, N., Kim, Y. -. J., Ribeiro, C., Dickson, B. J. A receptor that mediates the post-mating switch in Drosophila reproductive behaviour. Nature. 451 (7174), 33-37 (2008).
  15. Yang, C. -. H., et al. Control of the postmating behavioral switch in Drosophila females by internal sensory neurons. Neuron. 61 (4), 519-526 (2009).
  16. Häsemeyer, M., Yapici, N., Heberlein, U., Dickson, B. J. Sensory neurons in the Drosophila genital tract regulate female reproductive behavior. Neuron. 61 (4), 511-518 (2009).
  17. Rezával, C., Pavlou, H. J., Dornan, A. J., Chan, Y. -. B., Kravitz, E. A., Goodwin, S. F. Neural circuitry underlying Drosophila female postmating behavioral responses. Curr. Biol. , 1-11 (2012).
  18. Haussmann, I. U., Hemani, Y., Wijesekera, T., Dauwalder, B., Soller, M. Multiple pathways mediate the sex-peptide-regulated switch in female Drosophila reproductive behaviours. Proc. Biol. Sci. 280 (1771), 20131938-20131938 (2015).
  19. Krupp, J. J., et al. Social experience modifies pheromone expression and mating behavior in male Drosophila melanogaster. Curr. Biol. 18 (18), 1373-1383 (2008).
  20. Billeter, J. C., Jagadeesh, S., Stepek, N., Azanchi, R., Levine, J. D. Drosophila melanogaster females change mating behaviour and offspring production based on social context. Proc. Biol.l Sci. 279 (1737), 2417-2425 (2012).
  21. Krupp, J. J., Billeter, J. -. C., Wong, A., Choi, C., Nitabach, M. N., Levine, J. D. Pigment-dispersing factor modulates pheromone production in clock cells that influence mating in Drosophila. Neuron. 79 (1), 54-68 (2013).
  22. Imhof, M., Harr, B., Brem, G., Schlötterer, C. Multiple mating in wild Drosophila melanogaster revisited by microsatellite analysis. Mol. Ecol. , 915-917 (1998).
  23. Ochando, M. D., Reyes, A., Ayala, F. J. Multiple paternity in two natural populations (orchard and vineyard) of Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 93 (21), 11769-11773 (1996).
  24. Becher, P. G., et al. Yeast, not fruit volatiles mediate Drosophila melanogaster attraction, oviposition and development. Func. Ecol. 26 (4), 822-828 (2012).
  25. Montell, C. Drosophila visual transduction. Trends Neurosci. 35 (6), 356-363 (2012).
  26. Ejima, A., Griffith, L. C. Assay for courtship suppression in Drosophila. Cold Spring Harbor Prot. 2011 (2), 5575 (2011).
  27. Crickmore, M. A., Vosshall, L. B. Opposing Dopaminergic and GABAergic Neurons Control the Duration and Persistence of Copulation in Drosophila. Cell. 155 (4), 881-893 (2013).
  28. Bretman, A., Fricke, C., Chapman, T. Plastic responses of male Drosophila melanogaster to the level of sperm competition increase male reproductive fitness. Proc. Biol. Sci. 276 (1662), 1705-1711 (2009).
  29. Dukas, R., Jongsma, K. Costs to females and benefits to males from forced copulations in fruit flies. Anim. Behav. 84 (5), 1177-1182 (2012).
  30. Yorozu, S., et al. Distinct sensory representations of wind and near-field sound in the Drosophila brain. Nature. 457 (7235), 201-205 (2009).
check_url/es/55690?article_type=t

Play Video

Citar este artículo
Gorter, J. A., Billeter, J. A Method to Test the Effect of Environmental Cues on Mating Behavior in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (125), e55690, doi:10.3791/55690 (2017).

View Video