Summary

FRET de alta precisão em nível de molécula única para determinação de estrutura de biomoléculas

Published: May 13, 2017
doi:

Summary

Um protocolo para experiências FRET de alta precisão no nível de molécula única é apresentado aqui. Adicionalmente, esta metodologia pode ser utilizada para identificar três estados conformacionais no domínio de ligação ao ligando do receptor N-metil-D-aspartato (NMDA). Determinar distâncias precisas é o primeiro passo para construir modelos estruturais baseados em experimentos FRET.

Abstract

Apresenta-se aqui um protocolo sobre como realizar medições de distância de interdise de alta precisão usando a transferência de energia de ressonância de Förster (FRET) no nível de molécula única no modo de detecção de fluorescência multiparâmetro (MFD). O MFD maximiza o uso de todas as "dimensões" da fluorescência para reduzir os artefatos fotofísicos e experimentais e permite a medição da distância interdye com uma precisão de até 1 Å em biomoléculas rígidas. Este m�odo foi utilizado para identificar tr� estados conformacionais do dom�io de liga�o ao ligando do receptor N-metil-D-aspartato (NMDA) para explicar a activa�o do receptor ap� liga�o ao ligando. Ao comparar as estruturas cristalográficas conhecidas com medidas experimentais, concordaram em menos de 3 Å para biomoléculas mais dinâmicas. Recolher um conjunto de restrições de distância que cobre toda a dimensionalidade das biomoléculas tornaria possível fornecer um modelo estrutural de biomolécula dinâmicaEs.

Introduction

Um objetivo fundamental dos estudos de biologia estrutural é desvendar a relação entre a estrutura ea função das máquinas biomoleculares. A primeira impressão visual de biomoléculas ( por exemplo, proteínas e ácidos nucleicos) ocorreu na década de 1950 através do desenvolvimento de cristalografia de raios X 1 , 2 . A cristalografia de raios-X fornece informações estruturais estáticas de alta resolução restritas pela embalagem de cristal. Portanto, a imobilidade inerente dos modelos estruturais de raios X evita a natureza dinâmica das biomoléculas, um fator que afeta a maioria das funções biológicas 3 , 4 , 5 . A ressonância magnética nuclear (RMN) 6 , 7 , 8 proporcionou uma solução alternativa ao problema resolvendo modelos estruturais em soluções aquosas. Uma grande vantagemDe RMN é a sua capacidade de recuperar a natureza dinâmica intrínseca de biomoléculas e conjuntos conformacionais, o que ajuda a esclarecer as relações intrínsecas entre estrutura, dinâmica e função 3 , 4 , 5 . No entanto, a RMN, limitada pelo tamanho da amostra e grandes quantidades de amostra, requer estratégias de rotulagem complexas para sistemas maiores. Portanto, há uma necessidade premente de desenvolver métodos alternativos na biologia estrutural.

Historicamente, a transferência de energia de ressonância de Förster (FRET) 9 não assumiu um papel importante na biologia estrutural devido ao equívoco de que o FRET fornece medições de distância de baixa precisão. O objetivo deste protocolo é revisar a capacidade do FRET de determinar distâncias na escala nanométrica, de tal forma que essas distâncias possam ser utilizadas na construção de modelos estruturais de biomoléculas. O primeiro verificador experimentalA dependência da dependência de R 6 com a eficiência de FRET foi feita por Stryer em 196710, medindo poliprolinas de vários comprimentos como uma "régua espectroscópica". Um experimento semelhante foi realizado no nível de molécula única em 2005 11 . As moléculas de poliprolina revelaram-se não ideais e, assim, as moléculas de DNA de cadeia dupla foram utilizadas mais tarde 12 . Isto abriu a janela para medidas de distância precisas ea idéia de usar FRET para identificar propriedades estruturais de biomoléculas.

FRET é óptima quando a distância interdyte varia de ~ 0,6-1,3 R 0 , onde R 0 é a distância de Förster. Para os fluoróforos típicos utilizados em experiências FRET de molécula única, R0 é ~ 50 Å. Tipicamente, FRET oferece muitas vantagens sobre outros métodos na sua capacidade de resolver e diferenciar as estruturas e dinâmicas emHeterogêneos: (i) Devido à sensibilidade final da fluorescência, as experiências FRET de uma única molécula 13 , 14 , 15 , 16 podem resolver conjuntos heterogêneos contando diretamente e caracterizando simultaneamente as estruturas de seus membros individuais. (Ii) Vias de reação complexas podem ser decifradas diretamente em estudos FRET de molécula única, porque não é necessária sincronização de um conjunto. (Iii) FRET pode acessar uma ampla gama de domínios temporais que abrangem mais de 10 décadas no tempo, cobrindo uma ampla variedade de dinâmicas biologicamente relevantes. (Iv) Experiências de FRET podem ser realizadas em quaisquer condições de solução, in vitro e in vivo . A combinação de FRET com microscopia de fluorescência permite o estudo de estruturas moleculares e interações diretamente em células vivas 15 , 16 , </ Sup> 17 , 18 , 19 , mesmo com alta precisão 20 . (V) FRET pode ser aplicado a sistemas de praticamente qualquer tamanho ( por exemplo, oligómeros de poliprolina 21 , 22 , 23 , 24 , Hsp90 25 , transcriptase reversa de HIV 26 e ribossomas 27 ). (Vi) Finalmente, uma rede de distâncias que contém toda a dimensionalidade de biomoléculas poderia ser usada para derivar modelos estruturais de moléculas estáticas ou dinâmicas 18 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 ,Ref "> 35 , 36 , 37 .

Portanto, a espectroscopia FRET de molécula única pode ser usada para derivar distâncias que são precisas o suficiente para serem usadas para modelagem estrutural restrita à distância 26 . Isto é possível tirando proveito da detecção de fluorescência multiparâmetro 28 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42 , que utiliza oito dimensões de informação de fluorescência ( isto é, espectro de excitação, espectro de fluorescência, anisotropia, tempo de vida de fluorescência, rendimento quântico de fluorescência, O tempo macroscópico, as intensidades de fluorescência e a distância entre fluoróforos) para proporcionar precisão e precisão de restrições de distância. Adicionalmente, a excitação intercalada pulsada (PIE) é combinada com MFD(PIE-MFD) 42 para monitorizar a fluorescência do receptor de excitação directo e para seleccionar eventos de molécula única resultantes de amostras contendo uma estequiometria de um dador para um aceitador de 1: 1. Uma configuração PIE-MFD típica usa laser de excitação intercalado de dois impulsos conectado a um corpo de microscópio confocal, onde a detecção de fótons é dividida em quatro canais diferentes em diferentes janelas espectrales e características de polarização. Mais detalhes podem ser encontrados na Figura 1 .

É importante notar que o FRET deve ser combinado com métodos computacionais para obter modelos estruturais de tipo atomístico que sejam consistentes com os resultados do FRET 26 , 30 . Não é o objetivo do presente protocolo examinar a metodologia associada para construir modelos estruturais com distâncias derivadas de FRET. No entanto, estas abordagens foram aplicadas em combinação com outras técnicas ( por exemplo, dispersão de raios-X de ângulo pequenoOu ressonância paramagnética eletrônica), dando origem ao campo da biologia estrutural integrativa 43 , 44 , 45 , 46 . O objetivo atual é abrir caminho para a FRET como ferramenta quantitativa na biologia estrutural. Como exemplo, esta metodologia foi utilizada para identificar três estados conformacionais no domínio de ligação ao ligando (LBD) do receptor N-metil-D-aspartato (NMDA). O objetivo final é superar as limitações acima mencionadas e trazer FRET entre os métodos integradores utilizados para a determinação estrutural de biomoléculas, proporcionando distâncias medidas com alta precisão.

Protocol

1. Preparação de tampão de PBS e tratamento de câmara NOTA: Use um revestimento de laboratório e luvas descartáveis ​​ao realizar experimentos químicos úmidos. Use proteção para os olhos quando alinhar o laser. Preparação tampão PBS Dissolver 4,5 g de Na2HPO4, 0,44 g de NaH2PO4 e 3,5 g de NaCl em 400 mL de água destilada. Assegurar um pH de 7,5 e esterilizar a solução por autoclave num ciclo de líquido durante 1 h (dependendo do siste…

Representative Results

Em experiências típicas de smFRET utilizando uma configuração MFD (linhas de laser: 485 nm a 60 μW e 640 nm a 23 μW, secção 5.1), a amostra de fluorescência é diluída para uma concentração de baixo-picomolar (10-12M = 1 pM) e colocada Em um microscópio confocal, onde um pulso de laser de sub-nanossegundo excita moléculas marcadas que se difundem livremente através de um volume de excitação. Um volume confocal típico é <4 femtolitros (fL). Em concentrações tão ba…

Discussion

Neste trabalho, apresenta-se o protocolo para alinhar, calibrar e medir distâncias de interdise com alta precisão usando experimentos FRET de molécula única PIE-MFD. Ao calibrar cuidadosamente todos os parâmetros instrumentais, pode-se aumentar a precisão das distâncias medidas e alcançar a precisão de Angstrom. Para isso, são utilizados vários histogramas multidimensionais para analisar e identificar populações para posterior caracterização. Utilizando o tempo macro médio para verificar a estabilidade d…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

VJ e HS reconhecem apoio de NIH R01 GM094246 a VJ. HS reconhece fundos de arranque do Clemson University Creative Inquérito Programa e do Centro de Materiais Ópticos Ciência e Engenharia de Tecnologias Clemson University. Este projeto foi também apoiado por uma bolsa de treinamento do Centro Keck para Treinamento Interdisciplinar de Biociências dos Consórcios da Costa do Golfo (NIGMS Grant No. 1 T32GM089657-05) e da Fundação Schissler para Estudos Translacionais de Doenças Humanas Comuns a DD. O conteúdo é exclusivamente da responsabilidade dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais dos Institutos Nacionais de Saúde.

Materials

charcoal Merck KGaA K42964486 320
syringe filter Fisherbrand 09-719C size: 0.20um
chambered coverglass Fisher Scientific 155409 1.5 borosilicate glass, 8 wells
microscope cover glass Fisher Scientific 063014-9 size: 24X60-1.5
Nuclease free water Fisher Scientific 148859 nuclease free
tween-20 Thermo Scientific 28320 10% solution of Polysorbate 20
acceptor DNA strand (High FRET) Integrated DNA Technologies 178124895 5´-d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG AT(Cy5)C GCC TTA AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)
acceptor DNA strand (Low FRET) Integrated DNA Technologies 177956424 5´-d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG ATC GCC TT(Cy5)A AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)
donor DNA strand Integrated DNA Technologies 177951437 5´ -d(GCA ATA CTT GGA CTA GTC TAG GCG AAC GTT TAA GGC GAT CTC TGT TT(Alexa488)A CAA CTC CGA AAT AGG CCG)
DNA strand (No FRET) Integrated DNA Technologies 5´ -d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG ATC GCC TTA AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)
thermal cycler Eppendorf E6331000025 nexus gradient
Alexa Fluor 488 C5 Maleimide Thermo Scientific A10254 termed cyan-green fluorophore in the manuscript
Alexa Fluor 647 C2 Maleimide Thermo Scientific A20347 termed far-red fluorophore in the manuscript
Rhodamine 110 Sigma-Aldrich 83695-250MG
Rhodamine 101 Sigma-Aldrich 83694-500MG
LB Broth, Miller Fisher Scientific BP1426 For culture of E. coli
Ampicillin Sigma-Aldrich A0166 Used at 100 ug/ml final concentration in selective LB medium to maintain plasmid selection
Tetracyline  Calbiochem 58346 Used at 12.5 ug/ml final concentration in selective LB medium to maintain gor (flutathione reductase) mutation in Origami B(DE3) strains to facilitate disulfide bond oxidation
Kanamycin Fisher Scientific BP906-5 Used at 15 ug/ml final concentration in selective LB medium to maintain trxB (rhioredoxin reductase) mutation in B(DE3) stains to facilitate disulfide bond oxidation
Origami B(DE3) Competent Cells Millipore 70837-3 Competent E. coli cells for expression of protein with disulfide bridges
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) Fisher Scientific BP1755 For induction of E. coli protein expression
HiTrap Chelating HP GE Life Sciences 17-0409-01 For Large-scale FPLC Purification of His-tagged protein
Imidazole Sigma-Aldrich 56749
Ni-NTA Agarose  Qiagen 30210
PD-10 Desalting Column GE Life Sciences 17-0851-01
AktaPurifier GE Life Sciences 28406264 FPLC Instrument
Dialysis tubing Spectrum labs 132562 15 kD MWCO 24 mm Flath width, 10 meters/roll
Dichroics Semrock FF500/646-Di01-25×36 500/646 BrightLight
50/50 Beam splitter polarizer Qioptiq Linos  G33 5743 000 10×10 film polarizer
Green pass filer Chroma ET525/50m ET525/50m 25 mm diameter mount
Red pass filter Chroma ET720/150m ET720/150m 25 mm diameter mount
Power Meter ThorLabd PM200
UV-Vis spectrophotometer Varian Cary300Bio
Fluorolog 3 fluorometer Horiba FL3-22-R3
Fluorohub TCSPC controller Horiba Fluorohub-B TCSPC electronics for ensemble measurements
NanoLed 485L Horiba 485L Blue diode laser
NanoLed 635L Horiba 635L Red diode laser
Olympus IX73 Microscope Olympus IX73P2F Microscope frame
PMA 40 Hybrid Detector PicoQuant GmbH 932200, PMA 40 Optimized for green detection
PMA 50 Hybrid Detector PicoQuant GmbH 932201, PMA 50 Optimized for ed shifter sensitivity
485nm laser PicoQuant GmbH LDH-D-C-485
640nm laser PicoQuant GmbH LDH-D-C-640
Hydraharp 400 and TTTR acqusition software PicoQuant 930021 Picosecond event timer and Time Correlated Single Photon Coutning Unit, includes TTTR acqusition software
SEPIA II SLM 828 and SEPIA software PicoQuant 910028 Laser driver for picosecond pulses , includes SEPIA software controller.
computer Dell optiplex 7010 cpu: i7-3770 ram:16GB
FRET Positioning and Screening (FPS) software Heinrich Heine Unviersity It include the Accesibel Volume clacualtor available at http://www.mpc.hhu.de/software/fps.html
MFD suite Heinrich Heine Unviersity It includes the BIFL software package Paris; Margarita for visualization of the multiparameter hisotrams, and Probability Distribution Analysis software availabel at http://www.mpc.hhu.de/software/software-package.html

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Ma, J., Yanez-Orozco, I. S., Rezaei Adariani, S., Dolino, D., Jayaraman, V., Sanabria, H. High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination. J. Vis. Exp. (123), e55623, doi:10.3791/55623 (2017).

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