这里描述的是一种分阶段的行为筛选方法,可用于筛选在β淀粉样变性和tau蛋白病的转基因小鼠模型中对体内功效的认知功能运动行为进行筛选的化合物。这些方法被优化以筛选化合物用于短期和工作记忆任务中的活动。
在这里,我们描述了一种分阶段的行为测试方法,可用于筛选在β淀粉样变性和tau蛋白病的转基因小鼠模型中对体内功效的认知和功能运动行为的化合物的筛选。范式包括Y迷宫中自发交替的测试,新颖的对象识别和肢体扣紧。选择这些测试是因为:1)询问认知或运动领域的功能以及与人类疾病状态相关的相关神经电路,2)具有明确界定的终点3)可以轻松实施质量控制检查4)中等吞吐量格式,以及5)调查员几乎不需要干预。这些方法设计用于寻找筛选化合物用于短期和工作记忆任务或与阿尔茨海默病小鼠模型相关的功能运动行为的研究者。这里描述的方法使用行为测试年龄不同的大脑区域包括海马和各种皮层区域。要求认知测试专门评估由单个脑区介导的认知的研究者可以使用这些技术补充其他行为测试。
阿尔茨海默病(AD)是进行性神经变性疾病,导致认知衰退衰弱,影响全球约4400万人。目前尚无AD治疗可以进行疾病修复,强调迫切需要临床前发现这种疾病的新型治疗策略。已经创建了许多不同的转基因小鼠模型,其重述了AD1,2的各个方面,包括在患者中破坏的认知结构域的缺陷3 。这些小鼠模型代表有助于在体内有效筛选的工具。
当评估化合物潜在的体内功效时,必须采取分阶段的方法,筛选适当的认知领域的功效,还可以监测可能影响特定终点的行为ssess认知AD的许多转基因小鼠模型表现出多动症和其他可能干扰特定认知测试的行为,并禁止其用于药物筛选4 。此外,对于在药物筛选环境中实施的方法,所使用的特定测试应至少保持适度的产量,具有明确定义的终点,以及调查人员最少干预的程序。使用这些标准,可以实施行为屏幕,其显示复合筛选所需的再现性,低的测定内和测定间差异以及效果尺寸。这里详细描述了我们用于筛选有效减轻β-淀粉样变性和tau蛋白病转基因小鼠模型中存在的认知和运动表型的化合物的方法5,6 。所描述的方法适用于l中报告的常用行为范例迭代7 ,具有特定的优化和质量控制检查,以便它们可以用于与AD相关的转基因小鼠模型。该协议可用于各种数据采集和分析系统,并假设调查员具有相关软件的工作知识。
技术对现有方法的重要意义
该方法设计用于筛选化合物在β-淀粉样变性和tau蛋白病的转基因小鼠模型中的体内活性。这里使用的分期方法确保检测与AD 3相关的认知领域中的有效化合物。此外,此处详细介绍的方法使用具有明确定义的端点的行为测试,易于实施的质量控制检查,可以以适度的吞吐量格式运行,并且几乎不需要调查员的干预。这些特征导致在动物和跨群体中表现出良好的再现性的测定法,其导致低的体内和分析间差异和效应大小(2≤f≤6),其足够强大以支持药物发现环境中的行为分析。
Pr。中的关键步骤otocol
用于AD药物发现的许多小鼠模型表现出与高度焦虑和侵略相一致的行为。这使得处理习惯对于执行此处描述的任何行为测试至关重要。由于这些测试依赖于无动力的行为,由于过度活跃和焦虑或侵略性的小鼠,研究者的粗暴处理可能会显着影响性能。焦虑增加可能导致执行任务失败,降低了测试的整体力量。此外,竞技场的光线水平对于促进每次测试所需的自发运动至关重要。明亮的光线往往会增加焦虑,抑制啮齿动物的运动,因此应注意调整环境光线水平至30-35勒克斯。
该过程的另一个重要方面是最小化强烈的环境线索,这将妨碍动物执行任务的能力。清洁竞技场和运动之间的对象是必不可少的,因为小鼠被吸引到环境中的新鲜气味。未能彻底清洁竞技场和物体可能会导致鼠标的自发活动倾斜,并掩盖真正的认知表现。调查员也应尽量减少在执行这些程序时使用个人卫生用品和古龙水/香水。最后,啮齿动物在许多公开行为20中表现出强大的昼夜和昼夜变化,包括学习和记忆21 。因此,为了尽可能减少由于基础行为和认知表现的昼夜节律引起的差异,所有的测试都应该在同一时间进行队列和研究。
此外,具体地关于新颖的对象识别,样本和测试阶段之间的延迟间隔以及对象在环境中的选择和放置是关键参数。内存存在3种不同的形式:短期记忆ory(STM),中期记忆(ITM)和长期记忆(LTM) 22,23 。将样本和测试阶段之间的间隔从分钟(STM)更改为小时(ITM)或天数(LTM)将会更改程序12测试的内存类型。此外,在运行新颖的对象识别测试之前,应该在小鼠的测试队列中筛选许多对象,用于潜在的探索偏倚。在评估新颖的对象识别时,不能使用对测试队列过于吸引或排斥的对象。理想情况下,在测试中使用的所有对象,当放置在竞技场中时,将从幼稚的小鼠中引出相同的探索时间。物体的测试和优化不足可以显着降低新物体识别的力量。
修改和故障排除
有几个因素可能会增加这里描述的认知测试中的表观变异性。 AD的许多小鼠模型表现出超动力运动3 ,其可以掩盖或改变作为认知终点测量的行为。此外,越来越多的证据表明, 24,25,26甚至母亲基因型27可以影响AD小鼠模型中神经病理学和认知表型的发展和进展。意外的变化或未能实施行为任务可能是由于这些因素中的任何一个。当首次实施特定行为测试时,结果应始终按性别,年龄和母亲基因型分类。此外,应始终执行本程序中概述的质量检查,以确保多动症或其他定型行为不会干扰认知终点的量化。
信封熨烫也可以影响啮齿动物的自发探索行为。对研究人员无法察觉的气味或声音可能会吸引或排斥小鼠,从而偏离依赖于自发行为的认知测试结果。当初始建立Y迷宫或新颖的物体识别时,执行控制措施以确保在物体和/或环境的勘探中没有位置偏差是至关重要的。如果观察到位置偏差,调查员必须彻底审查环境,并可能调整照明,竞技场位置,测试室相对于设施中其他房间的位置( 即 ,不靠近高流量区域或重型设备)和竞技场清洁程序。
测试环境的习惯是在新颖的对象识别测试中实现最佳性能的关键。例如,总勘探时间较短可能是由于习惯不适。作为proc的替代方法本文概述的处理(第2节)和竞技场(第4.2节)习惯,习惯处理和测试环境可以每天3,5分钟的时间进行连续2天。
技术的局限性
与任何程序一样,这些行为测试有局限性。已经使用这些程序,因为它们测试各种皮层区域和海马的功能。如果小鼠模型在这些测试探测到的脑区域中没有显示功能缺陷,那么这些技术将不会有用。此外,我们选择了探索短期记忆的认知测试。如果化合物临床前评估的作用机制不会影响短期记忆,则应相应修改这些程序( 即增加样本 – 测试相间隔以测试长期记忆)。最后,这些测试使用没有动机的行为。因此,如果鼠标模型是exces活跃的活动或显示其他刻板行为,阻止对环境的探索,那么这些程序可能不是最佳的。作为替代方案,可以使用Tg2576或其他β-淀粉样变性小鼠模型的恐惧调理,或者用于rTg4510或其他小鼠模型的tau蛋白病3的空间水迷宫。
未来的应用
一旦这些程序已经在实验室中成功采用,可以进行几项修改或扩展,以评估额外的认知和功能运动措施。例如,改变新颖的对象识别任务以确定鼠标是否可以识别对象13的位置的改变。或者,不是使用对象,可以使用其他鼠标并实施社会识别测试。关于肢体夹紧和运动功能,可以用线悬挂和/或抓力测试来补充该测试。测试在这种方法中详细描述形成一个坚实的基础来筛选在 AD的翻译小鼠模型中具有体内功效的化合物,并且可以以许多方式进行调整或修饰以最好地询问特定的小鼠模型或满足独特药物发现程序的需要。
The authors have nothing to disclose.
作者没有确认。
Topscan Lite-High Throughput | Cleversys | Automated behavioral analysis. Includes cameras and video acquisition system, laptop. | |
ObjectScan | Cleversys | Software module for accurate object exploration quantification | |
Open field for mouse | Cleversys | CSI-OF-M | Arena for novel object recognition |
Y-maze for mouse | Custom | Arms: 30cm long, 10 cm wide, 20cm high walls, placed 120deg apart. | |
Camera mount for open field | Custom | Custom | 76 cm tall, 115 cm wide, cameras mounted @ 30cm in from either side. Two mounts, each covers two boxes. |
Camera mount for Y-maze | Custom | Custom | 76 cm tall, 115 cm wide, cameras mounted @ 30cm in from either side. One mount covers two mazes. |
Marbles | Inperial Toy | 8565 | Standard (15.5mm Dia) glass marbles. |
Dice | Cardinal Industries | 770 | Standard (0.650 inch) white dice with black dots. |
LOCTITE Fun-Tak | Henkel | B018A3AG0W | Standard blue sticky tak |
EtOH | Nexeo Solutions | 82452 | 100% Ethanol Diluted to 70% using distilled Water |
dH2O | Tulpenhocken Spring Water Co. | – | PA D.E.P. #31, NJ D.O.H. #0049, NYSHD Cert. #320 |
Paper towels | Procter & Gamble | B019DM86LA | Bounty, White |
Handheld video camera | Apple, Inc. | MKV92LL/A | Acquisition of Limb clasping video, Iphone 6S Plus (or functional equivalent). |
Gloves | SafePOINT, L.L.C. | GL640-2 | Standard, Powder free Latex Gloves, Medium |
Light meter | Dr. Meter | LX1330B | Lighting @ the bottom of Open Field= 35 LUX, Lighting @ bottom of Y-Maze= 32 LUX |
Bleach germicidal wipes | Clorox | Sterilization of equipment during & after use |