Bioluminescenza Imaging di Neuroinflammation in topi transgenici Dopo periferica inoculazione di alfa-sinucleina fibrille
Summary
Iniezione periferica di fibrille alfasinucleina nel peritoneo o linguetta di Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) topi che esprimono umana alfasinucleina con la mutazione A53T familiare e luciferasi di lucciola, può indurre neuropatologia, compreso neuroinflammation , nel loro sistema nervoso centrale.
Abstract
Per studiare il comportamento prione-come misfolded alfasinucleina, sono necessari modelli murini che permettono la trasmissione veloce e semplice di prionoids alfa-sinucleina, che causano neuropatologia all'interno del sistema nervoso centrale (CNS). Qui si descrive che intraglossal o iniezione intraperitoneale di fibrille alfasinucleina in bigenic Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) topi che iperesprimono alfasinucleina umano con la mutazione A53T dal promotore proteina prionica e luciferasi di lucciola da il promotore di proteina acida fibrillare gliale (GFAP), è sufficiente per indurre la malattia neuropatologiche. In confronto a omozigote Tg (M83 + / +) topi che sviluppano gravi sintomi neurologici che cominciano ad un'età di 8 mesi, eterozigote Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) gli animali rimangono liberi da malattia spontanea fino a raggiungere un all'età di 22 mesi. È interessante notare che l'iniezione di fibrille alfasinucleina tramite l'intraperitoneal percorso indotta malattia neurologica con paralisi in quattro dei cinque Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) topi con un tempo di incubazione medio di 229 ± 17 giorni. animali malati hanno mostrato gravi depositi di fosforilata alfa-sinucleina nel cervello e midollo spinale. Accumuli di alfa-sinucleina erano sarcosile insolubile e colocalized con ubiquitina e P62, e sono accompagnati da una risposta infiammatoria conseguente gliosi astrocitaria e microgliosis. Sorprendentemente, l'inoculazione di fibrille alfasinucleina nella lingua era meno efficace nel causare malattia con uno solo dei cinque animali iniettati mostrano alfasinucleina patologia dopo 285 giorni. I nostri risultati mostrano che l'inoculazione per via intraglossal e ancora di più per via intraperitoneale è idoneo ad indurre la malattia neurologica con caratteristiche rilevanti del sinucleinopatie a Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) topi. Ciò fornisce un nuovo modello per lo studio patogenesi prioni come indurred entro prionoids alfa-sinucleina in maggiore dettaglio.
Introduction
V'è una crescente evidenza che l'alfa-sinucleina ha caratteristiche che sono simili a quelli della proteina prionica, in particolare nella sua capacità di auto-seme e propagano misfolding tra cellule e lungo percorsi neuronali. La struttura, di alfa-sinucleina è indicato anche come 'prioni-like' o 'prionoid', ed è supportata da osservazioni in esperimenti di trapianto, che suggeriscono la trasmissibilità di misfolded alfa-sinucleina da neuroni malati a appena trapiantato neuroni sani 1, 2 , 3, 4. Anche l'iniezione diretta di misfolded alfasinucleina nel cervello o la periferia, per esempio il muscolo arti posteriori o parete intestinale, provoca una diffusione di alfasinucleina patologia a parti distali del SNC 5, 6, 7, <sup class = "xref"> 8, 9, 10. Abbiamo analizzato trasmissione di prionoids alfa-sinucleina tramite percorsi periferici in maggior dettaglio e affrontato la questione se misfolded alfasinucleina può neuroinvade del SNC dopo una singola iniezione intraperitoneale o intraglossal, una caratteristica che in precedenza era stato mostrato per prioni ma non per alfa misfolded sinucleina. Dopo l'iniezione dei prioni nella lingua, neuroinvasione del SNC avviene tramite propagazione lungo il nervo ipoglosso della lingua che conduce al nucleo del nervo ipoglosso, che si trova nel tronco cerebrale 11. Come un modello murino abbiamo scelto Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) topi che sovraesprimono il mutante A53T di umana alfasinucleina dal promotore prione, e luciferasi di lucciola sotto il controllo di un promotore GFAP per monitorare attivazione degli astrociti da bioluminescenza, come precedentemente indicato nel cervello diprioni infetti topi 12. Nelle nostre mani bigenic Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) i topi non hanno sviluppato la malattia fino a 23 mesi di età, come è stato dimostrato da altri 13. Una singola iniezione di fibrille alfasinucleina umani tramite l'intraglossal o rotta indotta malattia neurologica intraperitoneale con patologia nel cervello e midollo spinale di Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) mice sostengono l'ipotesi che prionoids alfa-sinucleina condividere caratteristiche importanti con prioni 14.
Protocol
Representative Results
Discussion
Iniezione periferica di fibrille alfasinucleina nel peritoneo di Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) topi rappresenta un metodo facile per indurre la malattia neurologica accompagnato da neuroinflammation ricapitolare caratteristiche importanti synucleinopathies. Analogamente, iniezione lingua rappresenta un altro percorso per neuroinvasione da prionoids alfa-sinucleina in topi transgenici ma è meno efficiente. Abbiamo scelto di interrompere i nostri esperimenti a 420 giorni dopo l'iniezione …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano Olga Sharma, Theresa Hundt, e il personale delle DZNE microscopia ed animali strutture per il supporto tecnico.
Materials
| anti-actin antibody | Merck Millipore | MAB1501 | |
| anti-alpha-synuclein, phospho S129 antibody [pSyn#64] | Wako | 015-25191 | |
| anti-alpha-synuclein, phospho S129 antibody [EP1536Y] | Abcam | ab51253 | |
| anti-GFAP antibody | Dako | Z0334 01 | |
| anti-IBA-1 antibody | Wako | 019-19741 | |
| anti-Sequestosome-1 (p62) antibody | Proteintech | 18420-1-AP | |
| anti-ubiquitin antibody [Ubi-1] | Merck Millipore | MAB1510 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Invitrogen | 14190169 | |
| Ketamine | Ratiopharm | 100 mg/kg | |
| Xylazine | Ratiopharm | 10 mg/kg | |
| 27-gauge syringe | VWR | 613-4900 | |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | PZN 4831850 | |
| Depilatory cream | Veet | ||
| Secureline lab marker | Neolab | 25040 | |
| D-luciferin potassium salt | Acris | LK10000 | 30 mg/mL stock solution |
| Thermomixer | Eppendorf | 5776671 | |
| Sonopuls Mini20 sonicator | Bandelin | 3648 | |
| IVIS Lumina II imaging system | PerkinElmer | ||
| Living Image 3.0 Software | PerkinElmer | ||
| Tg(M83+/-) mice or B6;C3-Tg(Prnp-SNCA*A53T)83Vle/J mice | The Jackson Laboratory | 004479 | |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-16 | |
| Narrow pattern forceps | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| N-laurylasarcosyl | Sigma | L5125-100G | |
| Optima Max-XP ultracentrifuge | Beckman Coulter | TLA-110 rotor | |
| Thickwall polycarbonate tubes | Beckman Coulter | 362305 | |
| NuPAG Novex 4-12% Bis-Tris Midi Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | WG1401BOX | |
| HRP conjugated antibody | Cayman | Cay10004301-1 | |
| IR Dye 680 conjugated antibody | LI-COR Biosciences | 926-68070 | |
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate | Thermo Fisher Scientific | 34075 | |
| Stella 3200 imaging system | Raytest | ||
| Odyssey infrared imaging system | LI-COR Biosciences | ||
| Tween 20 | MP Biomedicals | TWEEN201 | |
| Triton X-100 | Sigma | SA/T8787 | |
| Immobilon-FL PVDF membrane | Merck Millipore | IPFL00010 | |
| Xylol | Sigma | Roth | |
| Hydrogen peroxide | Sigma | SA/00216763/000500 | working solution 3% |
| Bovine serum albumine (BSA) | Thermo Fisher Scientific | A3294-100G | |
| Goat serum | Thermo Fisher Scientific | PCN5000 | |
| 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | working dilution 1:50,000 |
| Fluoromount media | Omnilab | SA/F4680/000025 | |
| LSM700 confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss | ||
| HALT protease and phosphatase inhibitors | Thermo Fisher Scientific | 10516495 | |
| Precellys 24-Dual homogenizer | Peqlab | 91-PCS24D | |
| Alexa Fluor 488 conjugated antibody | Thermo Fisher Scientific | A31619 | |
| Alexa Fluor 594 conjugated antibody | Thermo Fisher Scientific | A11005 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 10741395 | |
| Microtome RM2255 | Leica | ||
| LSM700 confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss |
Referencias
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