Aqui apresenta-se os protocolos para a purificação por afinidade de complexos de proteínas e a sua separação por PAGE nativa azul, seguido pelo perfil correlação protea utilizando espectrometria de massa quantitativo livre etiqueta. Este método é útil para resolver interactoma em complexos de proteínas distintas.
Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological processes. Affinity purification coupled to mass spectrometry (AP-MS) has become the method of choice for identifying protein-protein interactions. However, conventional AP-MS studies provide information on protein interactions, but the organizational information is lost. To address this issue, we developed a strategy to unravel the distinct functional assemblies a protein might be involved in, by resolving affinity-purified protein complexes prior to their characterization by mass spectrometry. Protein complexes isolated through affinity purification of a bait protein using an epitope tag and competitive elution are separated through blue native electrophoresis. Comparison of protein migration profiles through correlation profiling using quantitative mass spectrometry allows assignment of interacting proteins to distinct molecular entities. This method is able to resolve protein complexes of close molecular weights that might not be resolved by traditional chromatographic techniques such as gel filtration. With little more work than conventional AP-geLC-MS/MS, we demonstrate this strategy may in many cases be adequate for obtaining protein complex topological information concomitantly to identifying protein interactions.
Em células, a maioria das proteínas de desempenhar as suas funções através de interacções proteína-proteína transitórios ou através da formação de conjuntos de proteínas estáveis. Caracterizando interações proteína é crucial para os processos celulares totalmente entendimento. A purificação por afinidade em combinação com espectrometria de massa (AP-MS) é uma das estratégias mais vulgarmente aplicados para identificar interacções proteína nativa. melhorias significativas na capacidade do instrumento alcançados na última década fizeram esta abordagem extremamente poderoso. É importante notar que as interacções identificados por experiências de AP-MS incluem uma mistura de associações directas e indirectas entre isca e presas. Além disso, muitas vezes proteínas tomar parte em vários complexos diferentes dentro do mesmo contexto celular, que pode ter diferentes papéis biológicos, e, por conseguinte, os interactores que são identificados por AP-MS pode representar uma mistura de conjuntos de proteínas distintas ou entidades funcionais. Não é possível derivartal informação topológica, a priori, a partir das listas de mono-dimensional de proteínas gerados por simples experiências de AP-MS. No entanto, a técnica pode ser explorada para definir a arquitectura de complexos de proteínas por combinação com um ou mais métodos para resolver estes conjuntos.
A fim de resolver a topologia de interacções proteína identificada através de AP-EM, várias estratégias têm sido aplicadas. Uma abordagem consiste em realizar iterativos experiências AP-MS utilizando as presas identificados numa fase anterior de experiências como iscos 1. Embora muito informativo, esta é uma tarefa intensiva muito trabalho, tanto experimentalmente e analiticamente. Proteína de reticulação em combinação com a espectrometria de massa é cada vez mais utilizada para derivar informação topológica de complexos de proteína 2, 3, 4, 5. No entanto, ComputatioA análise final dos péptidos de ligação cruzada continua a ser uma tarefa difícil e, portanto, é o afunilamento no fluxo de trabalho. O advento de reagentes de ligação cruzada MS cliváveis deve facilitar o mapeamento dos resíduos de aminoácidos que estão em estreita proximidade em proteínas que interagem 6, 7. Outra alternativa é a de combinar a purificação por afinidade com técnicas de separação ortogonais anteriores 8, 9. Fraccionamento cromatográfico por filtração em gel ou de permuta iónica, ou fraccionamento em gradiente de sacarose foram também recentemente utilizado em combinação com espectrometria de massa quantitativo para descrever os complexos multiproteicos a um nível de todo o sistema, contornando o passo complexo de isolamento 10, 11, 12, 13. electroforese em gel de poliacrilamida nativa azul (BN-PAGE) tem sido amplamente aplicada parainvestigar interacções entre proteínas nativas, tipicamente as que envolvem complexos de proteína de membrana mitocondrial 14. Esta técnica de separação também foi recentemente utilizada em combinação com a quantificação de proteína livre de marcador e perfis de correlação, não só em complexos mitocondriais 15, 16, 17, mas também para desvendar outros complexos de proteínas a partir de células inteiras 18, 19. Colocámos a hipótese de que a combinação de purificação por afinidade com abordagens de fraccionamento nativas subsequentes e MS quantitativa deve fornecer uma estratégia útil para a resolução de múltiplos conjuntos de proteínas que contêm uma proteína particular.
Aqui, descrevemos um método que combina a purificação por afinidade à base de epitopo genérico com electroforese em gel de poliacrilamida nativa azul dos complexos isolados, seguido por SP massa quantitativoectrometry e perfilamento correlação proteína, para resolver os vários conjuntos de uma proteína pode ser envolvidos em. Empregamos rato embrionário de células estaminais em que uma protea de interesse fundida com uma etiqueta de epítopo é expresso a partir do locus endógeno para atingir perto de abundância fisiológico e assegurar nativa eficiente isolamento complexo. Esta abordagem desvenda as múltiplas interacções uma proteína envolve, resolvê-los em conjuntos distintos com base nos seus perfis de correlação, enquanto que não exige mais trabalho do que o convencional GELC-MS 20.
Aqui, nós descrevemos o uso de purificação por afinidade, seguido por electroforese em gel nativo azul em combinação com espectrometria de massa quantitativo para resolver complexos de proteínas. Esta abordagem oferece um método para desvendar listas de interacção proteína unidimensionais em conjuntos de proteínas funcionais.
Demonstramos o método baseado na utilização de proteínas marcadas no epitopo. No entanto, se uma linha celular que expressa uma proteína marcada não está disponível, uma alternativa poderia ser a utilização de anticorpos contra a proteína de interesse, desde que haja um peptídeo disponível para conseguir a eluição competitiva nativa. A quantidade de material de partida e a quantidade de grânulos pode ter de ser modificado, dependendo do nível de expressão da proteína alvo. Nós normalmente realizar este protocolo com 2-5 x 10 8 culas a partir de material, e esta é suficiente até mesmo para proteínas com baixo nível de expressão. A composição do tampão de lise deve ser escolhida empiricamente para atingirperto de completar a solubilização da isca. Este pode ser um desafio para alguns tipos de proteínas, em particular de ligao cromatina ou proteínas de membrana. Opções alternativas incluem o aumento da quantidade de sal, desde que o complexo de proteína sob estudo é estável em elevado teor de sal, ou utilizando ultra-sons e / ou tratamento com nuclease para proteínas de ligação da cromatina 20, 29. No caso de proteínas de membrana, interrupção, detergente para DDM ou digitonina 30 pode ser aconselhável. No caso de proteínas de ligação de ADN, é útil incluir uma nuclease como a Benzonase durante o passo de purificação 20. A remoção completa de ácidos nucleicos que assegura que as interacções entre proteínas detectadas ocorrer e não são mediados por ADN.
Um elemento crítico para considerar quando se utiliza esta abordagem é a estabilidade do complexo sob investigação. O procedimento é longo e pode envolver preservandog a proteína durante a noite complexo. Nós conseguimos o bom sucesso com dois complexos de cromatina remodelação (D. Bode e M. Pardo, dados não mostrados), mas isso deve ser avaliada. A etapa de purificação por afinidade pode ser encurtado, se necessário.
As técnicas alternativas que permitam fraccionamento nativa, tais como a cromatografia de exclusão de tamanho, têm sido amplamente utilizados durante mais de 50 anos para caracterizar os complexos de proteínas. Nós e outros autores mostraram que a resolução de PAGE nativa azul é superior à que seria possível utilizando cromatografia de exclusão por tamanhos 20, 31, 32, 33. Outra vantagem da página nativa azul é que ele não requer sistemas de cromatografia, que são caros, mas sim usa equipamento de proteína eletroforética que é generalizada em laboratórios. Em termos de hands-on tempo, este método não envolve mais trabalho do que o tradicional GELC-MS / MS aBORDAGEM ou fraccionamento cromatográfico offline. No entanto, como a maioria das técnicas de fraccionamento fazer, ele tem um limite para a sua resolução. Complexos que são muito homogénea ou perto da massa e forma podem ser para além da resolução oferecida por PAGE nativa azul, e, portanto, do protocolo, como descrito aqui pode não ser universalmente bem sucedido na resolução de complexos distintos com subunidades partilhados. Encorajadoramente, que têm tido sucesso na separação de dois complexos tetraméricos muito semelhantes que partilham três subunidades (M. Pardo, manuscrito em preparação).
Uma vez que a espectrometria de massa tem se tornado cada vez mais sensível, mesmo quantidades diminutas de interactores e contaminantes não-específicos podem ser detectados em amostras de AP-MS. A abordagem aqui apresentado pode auxiliar na discriminação de interactores reais a partir de contaminação de fundo na purificação por afinidade, concentrando-se a atenção sobre as proteínas com picos de migração que coincidem com os picos de migração isca em peso molecular mais elevado do que o deas proteínas monoméricas.
Diversos grupos têm usado técnicas de fraccionamento, seguido pelo perfil correlação proteína para delinear complexos de proteína à escala celular sem a necessidade de isolamento prévio 10, 11, 12, 34. No entanto, isso pode resultar em falha para detectar interacções sub-estequiométrico. A incorporação de um passo de enriquecimento através de purificação por afinidade pode ajudar a ultrapassar esta. A abordagem aqui descrita deve ser geralmente útil para explorar a topologia de complexos de proteínas e desvendar os vários complexos de uma dada proteína participa em dentro do mesmo contexto celular. A estratégia é simples e passíveis de laboratórios que não podem ter equipamentos fracionamento cromatográfico caro para resolver complexos de proteínas.
The authors have nothing to disclose.
This work was funded by the Wellcome Trust (WT098051).
Protein G Dynabeads | Life Technologies | 10003D | |
FLAG antibody M2 | Sigma-Aldrich | F1804 | |
Tween-20, protein grade, 10% solution | Millipore | 655206 | |
Dimethyl pimelimidate | Sigma-Aldrich | 80490 | |
0.2 M Triethanolamine buffer, pH 8.2 | Sigma-Aldrich | T0449 | |
3x FLAG peptide | Sigma-Aldrich | F4799 | |
Vivaspin 5K NMWCO, PES | Sartorius | VS0112 | |
NativePAGE 3-12% Bis-Tris gel | Life Technologies | BN1001 | |
20x NativePAGE Running Buffer | Life Technologies | BN2001 | |
20x NativePAGE Cathode Additive | Life Technologies | BN2002 | |
4x NativePAGE sample loading buffer | Life Technologies | BN2003 | |
NativeMARK | Life Technologies | LC0725 | |
NativePAGE 5% G-250 sample additive | Life Technologies | BN2004 | |
Nunc conical bottom 96-well plate, polypropylene | Thermo | 249944 | |
Multiscreen HTS 96-well filtration system | Thermo | MSDVN6550 | |
Nunc 96-well cap natural | Thermo | 276002 | |
TCEP (Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride) | Sigma-Aldrich | 646547 | |
Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I1149 | |
Acetonitrile, HPLC grade | Fisher Scientific | A/0627/17 | |
Trypsin, sequencing grade | Roche | 11418475001 | |
Software | |||
MaxQuant (software) | N.A. | N.A. | http://www.biochem.mpg.de/5111795/maxquant |
Perseus (software) | N.A. | N.A. | http://www.biochem.mpg.de/5111810/perseus |