Очищением протокол заказуНаша ВЭЖХ, который дает высокой чистоты бета-амилоида 42 и бета-амилоида 40 Пептиды, способные олигомеров формирования
Summary
Здесь мы приводим протокол с учетом очистки ВЭЖХ, которая дает высокой чистоты бета-амилоида (42) и А 42 бета-40 (Aβ40) пептиды амилоида, способными к образованию олигомеров. Амилоида бета является весьма агрегация склонными, гидрофобный пептид участвует в болезни Альцгеймера. Амилоидогенный природа пептида делает его очищение вызов.
Abstract
Amyloidogenic peptides such as the Alzheimer’s disease-implicated Amyloid beta (Aβ), can present a significant challenge when trying to obtain high purity material. Here we present a tailored HPLC purification protocol to produce high-purity amyloid beta 42 (Aβ42) and amyloid beta 40 (Aβ40) peptides. We have found that the combination of commercially available hydrophobic poly(styrene/divinylbenzene) stationary phase, polymer laboratory reverse phase – styrenedivinylbenzene (PLRP-S) under high pH conditions, enables the attainment of high purity (>95%) Aβ42 in a single chromatographic run. The purification is highly reproducible and can be amended to both semi-preparative and analytical conditions depending upon the amount of material wished to be purified. The protocol can also be applied to the Aβ40 peptide with identical success and without the need to alter the method.
Introduction
Болезнь Альцгеймера является нейродегенеративным расстройством, что эффекты, более 35 миллионов человек во всем мире. 1 сильно замешан в возникновении и развитии заболевания, является высоко агрегация склонными, гидрофобный пептид бета – амилоид (A & beta ; ). 2 A & beta ; в диапазоне от 36 до 43 аминокислот в длину, однако, полагают , что вариант 42-аминокислоты, бета – амилоида 42 ( А 42), является наиболее токсичным формой белка. 3 Это связано в основном со способностью к легко А 42 образовывать диффундирующие олигомерные видов, которые считаются особенно нейротоксические лица. 4 Для того , чтобы углубить наше понимание пептида Ар, важно регулярно получать высокую чистоту материала. Наличие следов примесей было показано, резко изменить свойства агрегации Склонность пептида. 5
Traditionally, высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) разделение гидрофобных пептидов , таких как A & beta ; было сделано за счет использования комбинации C 4 или C 8 на основе диоксида кремния и стационарные фазы кислой подвижной фазы. 6 Тем не менее, такие условия могут представлять проблему для очистки пептида. Низкая изоэлектрической точкой пептида A (ИЭТ приблизительно 5,5) 7 означает , что в кислых условиях, агрегации пептидов увеличивается , и в результате широкие, без разрешенных пиков ВЭЖХ, которые часто трудно выделить производятся (фиг.2А). Кроме того, такие широкие пики часто содержат примеси, которые могут повлиять на профиль агрегации пептида, и обычно требует последующего раундов очистки, которые могут существенно повлиять на количество пептида, полученного.
Поли (стирол / дивинилбензол) стационарная фаза, PLRP-S, представляет собой альтернативное средство Purifлнение гидрофобные пептиды. Неподвижная фаза была использована при очистке ряда различных белков и мессенджеров рибонуклеиновых кислот (мРНК). 8, 9 Неподвижная фаза PLRP-S не требует дополнительного алкильный лиганд для обратного разделения фаз, и что более важно , является химически стабильным при высоких рН , что приводит к дезагрегации пептида. 7 Здесь мы приводим протокол с учетом очистки ВЭЖХ , которая дает высокой чистоты бета – амилоида (42) и А 42 бета – 40 (Aβ40) пептиды амилоида.
Protocol
Representative Results
Discussion
Очистку ЖХВД пептида Ар сильно зависит от выбора как стационарной фазы, используемой для очистки и подвижной фазы, выбранного для элюирования пептида. Низкая изоэлектрической точкой пептида и высокой склонностью к агрегации оказывают традиционные хроматографические условия для раз?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить за их компании Agilent технической помощи. Кейт Маркхэм и Рафаэль Паломино начисляются за их первоначальной помощи в области синтеза и очистки пептида Ар и д-р Hsiau-Вэй Ли выразил благодарность за помощь в подготовке Рисунок 1 рукописи.
Materials
| Agilent 1260 Infinity II quarternary pump | Agilent | G7111B | http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-pumps-vacuum-degassers/1260-infinity-ii-quaternary-pump |
| Agilent 1260 Infinity II Dual variable wavelength detector | Agilent | G7114A | http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-detectors/1260-infinity-ii-variable-wavelength-detector |
| Agilent 1260 Infinity II Manual Injector fitted with 10 mL stainless steel sample loop | Agilent | 0101-1232 | http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-injection-systems/1260-infinity-ii-manual-injector |
| Agilent 1260 Infinity II Manual Injector fitted with 20 µL stainless steel sample loop | Agilent | G1328C | http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-injection-systems/1260-infinity-ii-manual-injector |
| Ring Stand Mounting Bracket | Agilent | 1400-3166 | |
| PEEK Tubing Blue (1/32" outer diameter х 0.010" internal diameter) | Thermo Scientific | 03-050-399 | |
| Agilent PLRP-S 300Å 8µm 25 х 300 mm column (Preparative) | Agilent | PL1212-6801 | http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-columns/biomolecule-separations/plrp-s-for-biomolecules#features |
| Agilent PLRP-S 300Å 8µm 7.5 х 300 mm (Semi-Preparative) | Agilent | PL1112-6801 | http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-columns/biomolecule-separations/plrp-s-for-biomolecules#features |
| Agilent PLRP-S 300Å 5 µm 4.6 x 250 mm (Analytical) | Agilent | PL1512-5501 | http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-columns/biomolecule-separations/plrp-s-for-biomolecules#features |
| Aβ42 or Aβ40 peptide | Synthesized in-house using a CEM liberty automated peptide synthesizer. | ||
| Ammonium Hydroxide (NH4OH, 28% solution) | Fisher Scientific | A669-500 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A998-4 | |
| HPLC grade water | Fisher Scientific | W5-4 | |
| Falcon 50 ml conical centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-954-49A | |
| Supelco PEEK Fitting One-piece fingertight, pkg of 5 ea | Sigma-Aldrich | Z227250 | |
| Normject 5cc sterile syringe | Fisher Scientific | 1481729 | |
| 16 Gauge SS Needle | Rheodyne | 3725-086 |
Referencias
- Querfurth, H. W., LaFerla, F. M. Alzheimer’s Disease. N. Engl. J. Med. 362 (4), 329-344 (2010).
- McGowan, E., et al. Aβ42 Is Essential for Parenchymal and Vascular Amyloid Deposition in Mice. Neuron. 47 (2), 191-199 (2005).
- Gong, Y., et al. Alzheimer’s disease-affected brain: Presence of oligomeric Aβ ligands (ADDLs) suggests a molecular basis for reversible memory loss. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (18), 10417-10422 (2003).
- Selkoe, D. J. Soluble Oligomers of the Amyloid β-Protein Impair Synaptic Plasticity and Behavior. Behav Brain Res. 192 (1), 106-113 (2008).
- Zagorski, M. G., Yang, J., Shao, H., Ma, K., Zeng, H., Hong, A. Methodological and Chemical Factors Affecting Amyloid β Peptide Amyloidogenicity. Methods Enzymol. 309, 189-204 (1999).
- Kim, W., Hecht, M. H. Mutations Enhance the Aggregation Propensity of the Alzheimer’s Aβ Peptide. J Mol Bio. 377 (2), 565-574 (2008).
- Fezoui, Y., et al. An improved method of preparing the amyloid beta-protein for fibrillogenesis and neurotoxicity experiments. Amyloid. 7 (3), 166-178 (2000).
- Zhelev, N. Z., Barratt, M. J., Mahadevan, L. C. Use of reversed-phase high-performance liquid chromatography on polystyrene-divinylbenzene columns for the rapid separation and purification of acid-soluble nuclear proteins. J Chromatogr A. 763 (1-2), 65-70 (1997).
- Thess, A., et al. Sequence-engineered mRNA Without Chemical Nucleoside Modifications Enables an Effective Protein Therapy in Large Animals. Mol Ther. 23 (9), 1456-1464 (2015).
- Warner, C. J. A., Dutta, S., Foley, A. R., Raskatov, J. A. Introduction of D-glutamate at a critical residue of Aβ42 stabilizes a pre-fibrillary aggregate with enhanced toxicity. Chem Eur J. 22 (34), 11967-11970 (2016).
- Thompson, J. A., Lim, T. K., Barrow, C. J. On-line High-performance Liquid Chromatography/Mass Spectrometric Investigation of Amyloid-β Peptide Variants Found in Alzheimer’s Disease. Rapid Commun. Mass Spectrom. 13 (23), 2348-2351 (1999).
- Layne, E. Spectrophotometric and turbidimetric methods for measuring proteins. Met. Enzymology. 3, 447-455 (1957).
- Ioannou, J. C., Donald, A. M., Tromp, R. H. Characterizing the secondary structure changes occurring in high density systems of BLG dissolved in aqueous pH 3 buffer. Food Hydro. 46, 216-225 (2015).
- Rahimi, F., Maiti, P., Bitan, G. Photo-Induced Cross-Linking of Unmodified Proteins (PICUP) Applied to Amyloidogenic Peptides. J. Vis. Exp. (23), e1071 (2009).
- Bitan, G., Kirkitadze, M. D., Lomakin, A., Vollers, S. S., Benedek, G. B., Teplow, D. B. Amyloid β-protein (Aβ) assembly: Aβ40 and Aβ42 oligomerize through distinct pathways. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (1), 330-335 (2003).
