La disección de las larvas de pez cebra de tejidos gonadales

El principal determinante del sexo femenino en salvaje cromosoma pez cebra 4 se pierde o se modifica en el pez cebra domesticado (es decir, las cepas de laboratorio comunes) ^1. En cambio, tienen un sistema de determinación del sexo poligénica acompañado por factores ambientales como la temperatura, la hipoxia, la disponibilidad de alimentos y la densidad de población. Los mecanismos detallados del desarrollo sexual del pez cebra no se entienden completamente. Las preguntas fundamentales tales como cuando se produce la determinación del sexo de pez cebra, lo que es la señal de la determinación del sexo primario (s) / son, y que los genes regulan la primera etapa de transformación gónada siguen sin respuesta ^{2, 3.}

En el proceso del desarrollo sexual de pez cebra, varias etapas importantes han sido reconocidos. En la etapa temprana de desarrollo, a partir de 4 hpf (horas después de la fecundación) germinales células primordiales (PGCs) someterse especificación, la migración a cresta genital yproliferación. Números PGC y las interacciones recíprocas entre las células germinales y las células somáticas son importantes para la diferenciación de las gónadas ^4. A los 13 dpf (días después de la fertilización), las gónadas están en la etapa indiferenciada. Por 17 dpf, las gónadas se desarrollan en los ovarios bi-potenciales en las hembras y los machos futuras. La transición apoptosis dependiente de ovario al testículo comienzan a las 21 a 25 dpf y puede continuar durante varias semanas. Por 35 dpf, el sexo de la gónada se ha determinado y la producción de gametos específico del sexo está en marcha en ambos ovarios y testículos ^{5, 6, 7.}

Hasta la fecha, se han propuesto diversos genes y mecanismos de determinación del sexo candidatos. Proteómica y análisis transcriptomic han aislado muchos genes con expresión dimorfismo sexual y estos genes se han utilizado para estudiar la diferenciación sexual en el pez cebra ^8, </sup> ^{9, 10.} Por ejemplo, en larvas de pez cebra, el gen cyp19a1a se expresa específicamente en el ovario pero no en el testículo ^{11, 12.} Además, el gen AMH se expresa débilmente en las células del folículo de la granulosa de ovarios, pero fuertemente en los testículos células de Sertoli ^13. En contraste, el gen vasa se expresa continuamente en las células germinales de ambos pez cebra hembra y macho, por lo que es un marcador gónada adecuado ^{14, 15.}

Investigando gonadales niveles de expresión génica es fundamental para comprender el mecanismo molecular de la determinación del sexo y diferenciación especialmente en la etapa de ovario bi-potencial ^{3, 9.} Sin embargo, el pequeño tamaño de larvas de pez cebra y correspondientemente pequeñas gónadas complicar el aislamiento de gónadal de tejido para análisis molecular más. Estudios previos utilizados diseccionaron región del tronco entero entre los opérculos y poro anal ^16. Esta preparación, aunque gónadas contienen, consiste en múltiples tejidos y órganos. Alternativamente, los animales transgénicos con la expresión de GFP-gónada específica tales como vasa: EGFP se utilizaron para el aislamiento de tejido gonadal a través de células activadas por fluorescencia (FACS) y captura por láser micro-disección ^{17, 18.} Sin embargo, su aplicación generalizada es limitado. A continuación, describimos un procedimiento simple para aislar el tejido gonadal de larvas de pez cebra a las 17 dpf y 25 dpf. Se demuestra la posición de las gónadas con respecto a otros órganos y aislar las gónadas morfológicamente intactas de los tejidos circundantes. Además, muestran los genes-gónadas específicos tales como vasa y cyp19a1a son altamente expresado en las gónadas aisladas en comparación con el tejido del tronco a través de PCR cuantitativa (qPCR) análisis. El presente protocolo permite la identificación, aislamiento, purificación de ARN y amplificación de genes específicos gonadales de larvas de pez cebra, permitiendo de este modo posterior análisis molecular de tejido gonadal ^19.