Summary

Instrueret differentiering af Primitive og endelige hæmatopoietisk ophav fra humane pluripotente stamceller

Published: November 01, 2017
doi:

Summary

Vi præsenterer her, humane pluripotente stamceller (hPSC) kultur protokoller, bruges til at differentiere hPSCs i CD34+ hæmatopoietisk stamfaderen. Denne metode bruger fase-specifikke manipulation af canonical WNT signalering til at angive celler udelukkende til enten det endelige eller primitive hæmatopoietisk program.

Abstract

Et af de vigtigste mål for regenerativ medicin er generation og vedligeholdelse af hæmatopoietisk stamceller (HSCs) afledt af humane pluripotente stamceller (hPSCs). Indtil for nylig, har indsatsen for at differentiere hPSCs i HSCs overvejende genereret hæmatopoietisk stamfaderen, der mangle HSC potentiale, og i stedet ligner blommesækken bloddannelsen. Disse resulterende hæmatopoietisk stamfaderen kan have begrænset nytte for in vitro- sygdom modellering af forskellige voksen hæmatopoietisk lidelser, navnlig til lymfoid lineages. Dog har vi for nylig beskrevet metoder til at generere erythro-myelo-lymfoide multilineage endelige hæmatopoietisk ophav fra hPSCs ved hjælp af en fase-specifikke styret differentiering protokol, som vi skitsere her. Gennem enzymatisk dissociation af hPSCs på basalmembranen matrix-belagt plasticware dannes embryoid organer (EBs). EBs er differentieret til mesoderm af rekombinante BMP4, som efterfølgende er fastsat til den endelige hæmatopoietisk program GSK3β-hæmmer, CHIR99021. Alternativt, primitive bloddannelsen er angivet ved PORCN-hæmmer, IWP2. Bloddannelsen drives videre gennem tilsætning af rekombinant VEGF og støttende hæmatopoietisk cytokiner. De resulterende hæmatopoietisk stamfaderen genereret ved hjælp af denne metode har potentiale til at blive brugt til sygdom og udviklingsmæssige modellering, in vitro.

Introduction

Humane pluripotente stamceller (hPSCs) defineres som omfattende både humane embryonale stamceller (hESCs) og menneskeligt inducerede pluripotente stamceller (hiPSCs), og har den unikke evne til ikke kun undergår selvfornyelse under passende vækstbetingelser, men også kapacitet til at differentiere sig til alle celletyper stammer fra de tre Kim lag: endoderm, mesoderm og ectoderm1. På grund af disse unikke evner holder hPSCs meget lovende for regenerativ medicin, sygdom modellering og cellebaserede behandlinger2. Mens flere celletyper har med succes blevet differentieret fra hPSCs, er en betydelig udfordring i vitro specifikationen af udelukkende voksen-lignende hPSC-afledte hæmatopoietisk stamceller (HSCs) og endelig hæmatopoietisk stamfaderen.

En sandsynlig barriere for udvikling af menneskelige HSCs fra hPSCs er tilstedeværelsen af flere hæmatopoietisk programmer inden for det menneskelige embryo3. Det første program, som opstår, betegnes “primitive bloddannelsen,” stammer senest extraembryonic blommesækken væv og kendetegnes bedst ved sin forbigående produktion af erythroblast ophav (EryP-CFC), makrofager og megakaryocytes. Navnlig dette program giver ikke anledning til HSCs, eller giver det anledning til T og B lymfoide stamceller. Dog give blommesækken forbigående anledning til begrænsede endelige hæmatopoietisk progenitorceller, såsom erythro-myeloid stamfader (EMP4,5,6,7,8) og erythroid-mangelfuld lymfoide-pulverlak Multipotente stamfader (LMPP9). Men hverken EMPs eller LMPPs er fuldt multipotente, eller i stand til af HSC-lignende engraftment i voksen modtagere. Derimod senere i udvikling, er klassisk defineret “endelige” hæmatopoietisk programmet angivet i regionen aorta-gonade-mesonephros af embryonet korrekt, giver anledning til alle voksne hæmatopoietisk lineages, herunder HSC. Specifikation af disse intra embryonale endelige hæmatopoietisk celler opstår i en hak-afhængige mode, via en endotel til hæmatopoietisk overgang fra hemogenic endotelet (han)3,10,11 ,12,13,14. Bortset fra rekonstitution kapacitet, kan multilineage potentielle og hak-afhængighed af disse celler bruges til at skelne disse endelige hæmatopoietisk ophav fra EMP og LMPP (gennemgik i referencer3,13 ).

Forståelse af de mekanismer, der regulerer primitive og endelige hæmatopoietisk specifikation fra hPSCs er sandsynligvis afgørende for reproducerbare produktion af endelige hæmatopoietisk stamfaderen på tværs af en bred vifte af hPSC linjer. Indtil for nylig, fandtes hPSC differentiering protokoller, der kunne adskille Multipotente primitive og endelige hæmatopoietisk stamfaderen ikke15,16,17,18, 19,20,21,22,23,24,25. Mange tilgange ved hjælp af føtal bovint serum (FBS) og/eller stromale Co kultur først skitserede hPSC differentiering, hæmatopoietisk potentiale med blandinger af primitive og endelige hæmatopoietisk potentielle15,16, 17,19,22,23,25. Yderligere, mange serumfrit hæmatopoietisk protokoller har beskrevet signal krav til specifikationen af mesoderm fra hPSCs, at havne hæmatopoietisk potentielle18,20,21, 24. dog som disse metoder stadig gav anledning til heterogene blandinger af begge programmer, deres anvendelse i kliniske applikationer og forståelse udviklingsmæssige mekanismer kan være begrænset.

Vi har for nylig bygget på disse undersøgelser, har skitseret de fase-specifikke signal krav til ACTIVIN/NODAL og WNT signalering i primitive og endelige hæmatopoietisk specifikation fra hPSC-afledte mesoderm18,26 . Sidstnævnte var særlig enestående, da dens anvendelse af fase-specifikke WNT signal manipulation giver mulighed for specifikation af enten udelukkende primitive eller udelukkende endelige hæmatopoietisk stamfaderen26. Under mesoderm specifikation, hæmning af canonical WNT signalering med PORCN hæmmer IWP2 resulterer i specifikationen af CD43+ EryP-CFC og myeloide progenitorceller, med ingen påviselige lymfoide potentiale. I skarp kontrast, stimulering af canonical WNT signalering med GSK3β-hæmmer, CHIR99021, under den samme fase af differentiering resulterede i den fuldstændige mangel på påviselig CD43+ EryP-CFC, mens han samtidig førte til den specifikation af CD34+CD43 han. Denne populationen besad myeloid, HBG-udtrykker erythroid og T-lymfoide potentiale. Efterfølgende analyser identificeret dette var han som mangler udtryk for CD7327,28 og CD18428, og dens hæmatopoietisk potentiale NOTCH-afhængige28. Yderligere, enkelt celle klonede analyser viste, at disse endelige hæmatopoietisk lineages kunne udledes af Multipotente enkelt celler28. Taget sammen, tyder disse undersøgelser på, at fase-specifikke WNT signalering manipulation kan angive enten ren primitive hæmatopoietisk progenitorceller, eller Multipotente NOTCH-afhængige endelige hæmatopoietisk stamfaderen.

Her, skitsere vi vores differentiering strategi, der giver udelukkende primitive eller endelige hæmatopoietisk progenitorceller, via manipulation af canonical WNT signalering under mesodermale mønstre, og deres downstream hæmatopoietisk lineage assays. Denne protokol er af stor værdi for efterforskere, der er interesseret i produktion af enten primitive eller endelige hæmatopoietisk ophav fra hPSCs for regenerativ medicin programmer.

Protocol

1. reagenser Hent celle linier; hESCs eller hiPSCs 1, mus embryonale fibroblaster (MEFs) 29, OP9-DL4 stroma 30 , 31. reagens fremstilles en 0,1% w/v opløsning af gelatine i PBS. Steriliseres ved autoklavering og opbevares ved 4 ° C efter aliquoting. Forbered gelatine-belagt plasticware. Pels 6-godt retter med 1,5 mL af 0,1% gelatine løsning. Inkuber i 15 …

Representative Results

En skematisk skildrer induktion af primitive og endelige hæmatopoietisk ophav fra hPSCs er illustreret i figur 1. Mesoderm mønster af canonical WNT signalering opstår under 2-3 dage af differentiering, efterfulgt af hæmatopoietisk stamfader specifikation. Repræsentative flow cytometric analyse og kolonidannende methylcellulose assays af hPSC-afledte hæmatopoietisk differentiering kulturer er v…

Discussion

Denne protokol beskriver en hurtig, serumfrit, stroma-fri metode til differentiering af enten primitive eller endelige hæmatopoietisk stamfaderen. Mesodermale specifikation af enten primitive eller endelige hæmatopoietisk stamfaderen kan opnås pålideligt, ved hjælp af vores protokol, som entydigt udnytter lille molekyle hæmmere af canonical WNT signalering. Fase-specifikke WNT aktivering af GSK3β hæmmer CHIR9902133 giver anledning til endelige hæmatopoietisk mesoderm, hvorimod WNT hæmnin…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbejde er blevet støttet af Department of Internal Medicine, Division af hæmatologi, Washington University School of Medicine. CD blev støttet af T32HL007088 fra National Heart, Lung, og Blood Institute. CMS blev støttet af en amerikansk samfund hæmatologi Scholar Award.

Materials

Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMD) Corning 10-016
Fetal Bovine Serum (FBS), ES cell rated Gemini Bioproducts 100-500
Fetal Bovine Serum (FBS) Hyclone SH30396.03
L-glutamine, 200 mM solution Life Technologies 25030-081
Penicillin-streptomycin Life Technologies 15070-063
0.25% Trypsin-EDTA Life Technologies 25200056
0.05% Trypsin-EDTA Life Technologies 25300054
Gelatin, porcine skin, Type A Sigma-Aldrich G1890
Alpha-MEM Life Technologies 12000-022
DMEM-F12 Corning 10-092-CV
Knock-out serum replacement Life Technologies 10828028 "KOSR"
Non-essential amino acids (NEAA) Life Technologies 11140050
b-mercaptoethanol, 55 mM solution Life Technologies 21985023
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich H1758
Fraction V, Bovine Serum Albumin Fisher Scientific BP1605
Ham's F12 Corning 10-080
N2 supplement Life Technologies 17502048
B27 supplement, no vitamin A Life Technologies 12587010
Stempro-34 (SP34) Life Technologies 10639011 "SP34"
Growth factor reduced Matrigel Corning 354230 "MAT"
L-absorbic acid Sigma-Aldrich A4403
Human serum transferrin Sigma-Aldrich 10652202001
Monothioglycerol (MTG) Sigma-Aldrich M6145
Collagenase B Roche 11088831001
Collagenase II Life Technologies 17101015
DNaseI Calbiochem 260913
Phosphate Buffered Saline (PBS) Life Technologies 14190144
bFGF R&D Systems 233-FB
BMP4 R&D Systems 314-BP
Activin A R&D Systems 338-AC
VEGF R&D Systems 293-VE
SCF R&D Systems 255-SC
IGF-1 R&D Systems 291-G1
IL-3 R&D Systems 203-IL
IL-6 R&D Systems 206-IL
IL-7 R&D Systems 207-IL
IL-11 R&D Systems 218-1L
TPO R&D Systems 288-TP
EPO Peprotech 100-64
Flt-3 ligand (FLT3-L) R&D Systems 308-FK
CHIR99021 Tocris 4423
IWP2 Tocris 3533
Angiotensin II Sigma-Aldrich A9525
Losartan Potassium Tocris 3798
CD4 PerCP Cy5.5 Clone RPA-T4 BD Biosciences 560650 Dilution 1:100; T cell assay
CD8 PE Clone RPA-T8 BD Biosciences 561950 Dilution 1:10; T cell assay
CD34 APC Clone 8G12 BD Biosciences 340441 Dilution 1:100; EHT assay
CD34 PE-Cy7 Clone 8G12 BD Biosciences 348801 Dilution 1:100; Hemogenic endothelium
CD43 FITC Clone 1G10 BD Biosciences 555475 Dilution 1:10; Hemogenic endothelium
CD45 APC-Cy7 Clone 2D1 BD Biosciences 557833 Dilution 1:50; T cell assay
CD45 eFluor450 Clone 2D1 BD Biosciences 642284 Dilution 1:50; EHT assay
CD56 APC Clone B159 BD Biosciences 555518 Dilution 1:20; T cell assay
CD73 PE Clone AD2 BD Biosciences 550257 Dilution 1:50; Hemogenic endothelium
CD184 APC Clone 12G5 BD Biosciences 555976 Dilution 1:50; Hemogenic endothelium
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) BD Biosciences 564907 Dilution 1:10,000; T cell assay
OP9 DL4 cells Holmes, R. and J.C. Zuniga-Pflucker. Cold Spring Harb Protoc, 2009. 2009(2): p. pdb prot5156
MethoCult H4034 Stemcell Technologies 4034 "MeC"
Milli-Q water purification system EMD Millipore
5% CO2 incubator Set at 37 C
Multigas incubator Set at 37 C, 5% CO2, 5% O2
6 well tissue culture plate Corning 353046
24 well tissue culture plate Corning 353226
6 well low-adherence tissue culture plate Corning 3471
24 well low-adherence tissue culture plate Corning 3473
35 mm tissue culture dishes Corning 353001
Blunt-end needle, 16 gauge Corning 305198
3 cc syringes Corning 309657
5 mL polypropylene test tube Corning 352063
5 mL polystyrene test tube Corning 352058
15 mL polypropylene conical Corning 430791
50 mL polypropylene conical Corning 430921
2 mL serological pipette Corning 357507
5 mL serological pipette Corning 4487
10 mL serological pipette Corning 4488
25 mL serological pipette Corning 4489
Cell scrapers Corning 353085
2.0 mL cryovials Corning 430488
5 mL test tube with 40 µM cell strainer Corning 352235
40 µM cell strainer Corning 352340
Cell culture centrifuge
Biosafety hood
FACS AriaII or equivalent
LSRii or equivalent
FlowJo software TreeStar
Water bath Set at 37 C
0.22 µM filtration system Corning
Autoclave
4 C refrigerator
-20 C Freezer
-80 C Freezer

Referencias

  1. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  2. Murry, C. E., Keller, G. Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development. Cell. 132 (4), 661-680 (2008).
  3. Ditadi, A., Sturgeon, C. M., Keller, G. A view of human haematopoietic development from the Petri dish. Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (1), 56-67 (2017).
  4. Chen, M. J., et al. Erythroid/myeloid progenitors and hematopoietic stem cells originate from distinct populations of endothelial cells. Cell Stem Cell. 9 (6), 541-552 (2011).
  5. McGrath, K. E., et al. Distinct Sources of Hematopoietic Progenitors Emerge before HSCs and Provide Functional Blood Cells in the Mammalian Embryo. Cell Rep. 11 (12), 1892-1904 (2015).
  6. McGrath, K. E., et al. A transient definitive erythroid lineage with unique regulation of the beta-globin locus in the mammalian embryo. Blood. 117 (17), 4600-4608 (2011).
  7. Palis, J., et al. Spatial and temporal emergence of high proliferative potential hematopoietic precursors during murine embryogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (8), 4528-4533 (2001).
  8. Palis, J., Robertson, S., Kennedy, M., Wall, C., Keller, G. Development of erythroid and myeloid progenitors in the yolk sac and embryo proper of the mouse. Development. 126 (22), 5073-5084 (1999).
  9. Boiers, C., et al. Lymphomyeloid contribution of an immune-restricted progenitor emerging prior to definitive hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 13 (5), 535-548 (2013).
  10. Bertrand, J. Y., et al. Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development. Nature. 464 (7285), 108-111 (2010).
  11. Hadland, B. K., et al. A requirement for Notch1 distinguishes 2 phases of definitive hematopoiesis during development. Blood. 104 (10), 3097-3105 (2004).
  12. Kumano, K., et al. Notch1 but not Notch2 is essential for generating hematopoietic stem cells from endothelial cells. Immunity. 18 (5), 699-711 (2003).
  13. Medvinsky, A., Rybtsov, S., Taoudi, S. Embryonic origin of the adult hematopoietic system: advances and questions. Development. 138 (6), 1017-1031 (2011).
  14. Robert-Moreno, A., Espinosa, L., de la Pompa, J. L., Bigas, A. RBPjkappa-dependent Notch function regulates Gata2 and is essential for the formation of intra-embryonic hematopoietic cells. Development. 132 (5), 1117-1126 (2005).
  15. Chadwick, K., et al. Cytokines and BMP-4 promote hematopoietic differentiation of human embryonic stem cells. Blood. 102 (3), 906-915 (2003).
  16. Davis, R. P., et al. Targeting a GFP reporter gene to the MIXL1 locus of human embryonic stem cells identifies human primitive streak-like cells and enables isolation of primitive hematopoietic precursors. Blood. 111 (4), 1876-1884 (2008).
  17. Kaufman, D. S., Hanson, E. T., Lewis, R. L., Auerbach, R., Thomson, J. A. Hematopoietic colony-forming cells derived from human embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (19), 10716-10721 (2001).
  18. Kennedy, M., et al. T lymphocyte potential marks the emergence of definitive hematopoietic progenitors in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Rep. 2 (6), 1722-1735 (2012).
  19. Ledran, M. H., et al. Efficient hematopoietic differentiation of human embryonic stem cells on stromal cells derived from hematopoietic niches. Cell Stem Cell. 3 (1), 85-98 (2008).
  20. Ng, E. S., et al. The primitive streak gene Mixl1 is required for efficient haematopoiesis and BMP4-induced ventral mesoderm patterning in differentiating ES cells. Development. 132 (5), 873-884 (2005).
  21. Pick, M., Azzola, L., Mossman, A., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. Differentiation of human embryonic stem cells in serum-free medium reveals distinct roles for bone morphogenetic protein 4, vascular endothelial growth factor, stem cell factor, and fibroblast growth factor 2 in hematopoiesis. Stem Cells. 25 (9), 2206-2214 (2007).
  22. Vodyanik, M. A., Bork, J. A., Thomson, J. A., Slukvin, I. I. Human embryonic stem cell-derived CD34+ cells: efficient production in the coculture with OP9 stromal cells and analysis of lymphohematopoietic potential. Blood. 105 (2), 617-626 (2005).
  23. Vodyanik, M. A., Thomson, J. A., Slukvin, I. I. Leukosialin (CD43) defines hematopoietic progenitors in human embryonic stem cell differentiation cultures. Blood. 108 (6), 2095-2105 (2006).
  24. Yu, C., et al. Retinoic acid enhances the generation of hematopoietic progenitors from human embryonic stem cell-derived hemato-vascular precursors. Blood. 116 (23), 4786-4794 (2010).
  25. Zambidis, E. T., Peault, B., Park, T. S., Bunz, F., Civin, C. I. Hematopoietic differentiation of human embryonic stem cells progresses through sequential hematoendothelial, primitive, and definitive stages resembling human yolk sac development. Blood. 106 (3), 860-870 (2005).
  26. Sturgeon, C. M., Ditadi, A., Awong, G., Kennedy, M., Keller, G. Wnt Signaling Controls the Specification of Definitive and Primitive Hematopoiesis From Human Pluripotent Stem Cells. Nat Biotechnol. 32 (6), 554-561 (2014).
  27. Choi, K. D., et al. Identification of the hemogenic endothelial progenitor and its direct precursor in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Rep. 2 (3), 553-567 (2012).
  28. Ditadi, A., et al. Human Definitive Haemogenic Endothelium and Arterial Vascular Endothelium Represent Distinct Lineages. Nat Cell Biol. 17 (5), 580-591 (2015).
  29. Conner, D. A. Mouse embryo fibroblast (MEF) feeder cell preparation. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 23, (2001).
  30. La Motte-Mohs, R. N., Herer, E., Zuniga-Pflucker, J. C. Induction of T-cell development from human cord blood hematopoietic stem cells by Delta-like 1 in vitro. Blood. 105 (4), 1431-1439 (2005).
  31. Schmitt, T. M., et al. Induction of T cell development and establishment of T cell competence from embryonic stem cells differentiated in vitro. Nat Immunol. 5 (4), 410-417 (2004).
  32. Holmes, R., Zuniga-Pflucker, J. C. The OP9-DL1 system: generation of T-lymphocytes from embryonic or hematopoietic stem cells in vitro. Cold Spring Harb Protoc. 2009 (2), (2009).
  33. Polychronopoulos, P., et al. Structural basis for the synthesis of indirubins as potent and selective inhibitors of glycogen synthase kinase-3 and cyclin-dependent kinases. J Med Chem. 47 (4), 935-946 (2004).
  34. Chen, B., et al. Small molecule-mediated disruption of Wnt-dependent signaling in tissue regeneration and cancer. Nat Chem Biol. 5 (2), 100-107 (2009).
  35. Sugimura, R., et al. Haematopoietic stem and progenitor cells from human pluripotent stem cells. Nature. , (2017).
  36. Ohgushi, M., et al. Molecular pathway and cell state responsible for dissociation-induced apoptosis in human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7 (2), 225-239 (2010).
  37. Peschle, C., et al. Embryonic—-Fetal Hb switch in humans: studies on erythroid bursts generated by embryonic progenitors from yolk sac and liver. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (8), 2416-2420 (1984).

Play Video

Citar este artículo
Dege, C., Sturgeon, C. M. Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (129), e55196, doi:10.3791/55196 (2017).

View Video