Summary

Dirige la diferenciación de progenitores hematopoyéticos primitivo y definitivo de las células madre Pluripotent humanas

Published: November 01, 2017
doi:

Summary

Aquí, presentamos pluripotentes humanas protocolos de cultura de la célula de vástago (hPSC), solía diferenciarse hPSCs a CD34+ de progenitores hematopoyéticos. Este método utiliza la manipulación de la fase específica de canónica WNT de señalización especificar las células exclusivamente ya sea definitivo o primitiva hematopoyética programa.

Abstract

Uno de los objetivos principales para la medicina regenerativa es la generación y mantenimiento de las células madre hematopoyéticas (HSCs) derivado de las células de vástago pluripotent humanas (hPSCs). Hasta hace poco, tratando de distinguir hPSCs en HSCs ha generado predominante progenitores hematopoyéticos que carecen de potencial HSC y en cambio, se asemejan a saco vitelino hematopoyesis. Estos progenitores hematopoyéticos resultantes pueden haber limitado utilidad en vitro modelado enfermedad de varios desordenes hematopoyéticos adultos, particularmente los de los linajes linfoides. Sin embargo, recientemente hemos descrito los métodos para generar progenitores hematopoyéticos definitivos del multilineage Eritro-mielo-linfoide de hPSCs utilizando un protocolo específico de etapa diferenciación dirigida, que esbozamos aquí. A través de la disociación enzimática de hPSCs en recipientes de plástico recubierto por la matriz de membrana basal, se forman cuerpos embryoid (EBs). EBs se distinguen al mesodermo por BMP4 recombinante, que posteriormente se especifica que el programa hematopoyético definitivo por el inhibidor de la GSK3β, CHIR99021. Alternativamente, la hematopoyesis primitiva se especifica por el inhibidor de PORCN, IWP2. La hematopoyesis más es conducida a través de la adición de recombinante VEGF y apoyo citoquinas hematopoyéticas. Los progenitores hematopoyéticos resultantes generados mediante este método tienen el potencial para ser utilizado para la enfermedad y desarrollo modelado, in vitro.

Introduction

Las células de vástago pluripotent humanas (hPSCs) se definen como englobando células de vástago embrionarias humanas (hESCs) y las células madre humanas pluripotentes inducidas (hiPSCs) y tiene la capacidad única no sólo en auto renovación bajo condiciones de crecimiento apropiado, pero también, la capacidad de diferenciarse en todos los tipos celulares derivados de las tres capas germinales: ectodermo, endodermo y mesodermo1. Debido a estas habilidades, hPSCs sostener la gran promesa para la medicina regenerativa, modelado de enfermedades y terapias basadas en células2. Mientras que varios tipos de células se han diferenciado con éxito de hPSCs, un desafío importante es la especificación en vitro de adulto hPSC-derivó las células madre hematopoyéticas (HSCs) y progenitores hematopoyéticos definitivos.

Una probable barrera para el desarrollo de HSCs humanas de hPSCs es la presencia de múltiples programas hematopoyéticas en el embrión humano3. El primer programa que emerge, denomina “hematopoyesis primitiva”, se origina dentro del tejido del saco vitelino extraembrionarias y mejor se caracteriza por su producción transitoria de progenitores erythroblast (EryP-CFC), macrófagos y megacariocitos. En particular, este programa no da lugar a las HSCs, ni da lugar a progenitores linfoides T y B. Sin embargo, el saco vitelino transitorio dan lugar a progenitores hematopoyéticos definitivas restringidos, como el progenitor mieloide Eritro (EMP4,5,6,7,8) y la eritroide deficiente linfoide cebada multipotent progenitora (LMPP9). Sin embargo, EMPs ni LMPPs son completamente multipotentes, o capaz de engraftment HSC-como en recipientes adultos. En cambio, más adelante en el desarrollo, el programa hematopoyético “definitivo” clásicamente definido se especifica en la región aorta-gónada-mesonefros del embrión adecuado, dando lugar a todos los linajes hematopoyéticos adultos, incluyendo el HSC. La especificación de estas células hematopoyéticas definitivas intra embrionarias ocurre de manera dependiente de la muesca, a través de una transición endotelial hematopoyético de hemogenic endotelio (él)3,10,11 ,12,13,14. Además de capacidad de reconstitución, el potencial del multilineage y muesca-dependencia de estas células pueden utilizarse para distinguir estos progenitores hematopoyéticos definitivos de la EMP y LMPP (revisado en las referencias3,13 ).

Comprender los mecanismos de especificación hematopoyética primitiva y definitiva de hPSCs es probablemente esencial para la producción reproducible de progenitores hematopoyéticos definitivos a través de una variedad de líneas hPSC. Hasta hace poco, hPSC protocolos de diferenciación que podrían separar multipotentes definitivos y primitivos progenitores hematopoyéticos no existían15,16,17,18, 19,20,21,22,23,24,25. Muchos enfoques con suero bovino fetal (FBS) y/o co-cultivo stromal en primer lugar describe el potencial hematopoyético de hPSC diferenciación, con mezclas de primitivo y definitiva hematopoyética potencial15,16, 17,19,22,23,25. Además, muchos protocolos sin suero hematopoyéticos han descrito los requisitos de señal para la especificación del mesodermo del hPSCs que alberga hematopoyética potencial18,20,21, 24. sin embargo, como estos métodos todavía dieron lugar a mezclas heterogéneas de ambos programas, su uso en aplicaciones clínicas y mecanismos del desarrollo de la comprensión puede ser limitada.

Recientemente hemos construido en estos estudios, después de haber descrito los requisitos de señal de la fase específica de ACTIVIN NODAL y WNT de señalización en la especificación hematopoyética primitiva y definitiva del mesodermo derivado hPSC18,26 . El último era particularmente único, como el uso de la manipulación de señales WNT fase específica permite la especificación de exclusivamente primitivo o exclusivamente de progenitores hematopoyéticos definitiva26. Durante la especificación del mesodermo, la inhibición de la señalización de WNT canónico con el inhibidor PORCN IWP2 resultados en la especificación de CD43+ EryP-CFC y progenitores mieloides, con ningún potencial linfoide detectable. En contraste, estimulación de canónica WNT de señalización con el inhibidor de la GSK3β, CHIR99021, durante la misma etapa de diferenciación dio lugar a la ausencia completa de CD43 detectable+ EryP-CFC, mientras que al mismo tiempo conduce a la Especificación de CD34+CD43 . Esta población poseía mieloide, HBG-expresando eritroides y linfoides T potencial. Posteriores análisis identificaron esto como falta de la expresión de su potencial hematopoyético, CD7327,28 y CD18428fue dependiente de la muesca28. Además, sola célula clonales análisis demostraron que estos linajes hematopoyéticos definitivos se pudieran derivar de las células multipotentes28. Tomados juntos, estos estudios indican que etapa específica WNT signaling manipulación puede especificar puros primitivos progenitores hematopoyéticos o multipotentes dependiente de la muesca definitiva de progenitores hematopoyéticos.

Aquí describiremos nuestra estrategia de diferenciación que los rendimientos de progenitores hematopoyéticos exclusivamente primitivo o definitivos, través de la manipulación de la canónica WNT de señalización durante mesodérmico modelando y su linaje hematopoyético posterior ensayos. Este protocolo es de gran valor para los investigadores que están interesados en la producción de progenitores hematopoyéticos ya sea primitivo o definitivas de hPSCs para aplicaciones de la medicina regenerativa.

Protocol

1. reactivos obtener células líneas; hESCs o hiPSCs 1, ratón fibroblastos embrionarios (MEFs) 29, OP9-DL4 estroma 30 , 31. preparación del reactivo preparar una solución al 0.1% p/v de gelatina en PBS. Esterilizar en autoclave y almacenar a 4 ° C después de tomar. Preparar los recipientes de plástico recubierta de gelatina. Capa 6 bien platos con 1,5…

Representative Results

Un esquema que representa la inducción de progenitores hematopoyéticos primitivo y definitivas de hPSCs se ilustra en la figura 1. Mesodermo patrones por canónica WNT de señalización se produce durante 2-3 días de diferenciación, seguido por la especificación de progenitoras hematopoyéticas. Análisis cytometric del flujo representativas y formadoras de ensayos de metilcelulosa de culturas …

Discussion

Este protocolo describe un método rápido, libre de suero, tejido conectador-libre para la diferenciación de progenitores hematopoyéticos ya sea primitivo o definitivos. Mesodérmico especificación de progenitores hematopoyéticos ya sea primitivo o definitivas puede lograrse confiablemente usando nuestro protocolo, que únicamente inhibidores de molécula pequeña de la señalización de WNT canónico. Activación de WNT etapa específica por el inhibidor de GSK3β CHIR9902133 da lugar a meso…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo ha sido apoyado por el Departamento de medicina interna, División de Hematología, Washington University School of Medicine. CD fue apoyado por T32HL007088 de la National Heart, Lung and Blood Institute. CMS fue apoyado por una sociedad americana de Hematología Scholar Award.

Materials

Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMD) Corning 10-016
Fetal Bovine Serum (FBS), ES cell rated Gemini Bioproducts 100-500
Fetal Bovine Serum (FBS) Hyclone SH30396.03
L-glutamine, 200 mM solution Life Technologies 25030-081
Penicillin-streptomycin Life Technologies 15070-063
0.25% Trypsin-EDTA Life Technologies 25200056
0.05% Trypsin-EDTA Life Technologies 25300054
Gelatin, porcine skin, Type A Sigma-Aldrich G1890
Alpha-MEM Life Technologies 12000-022
DMEM-F12 Corning 10-092-CV
Knock-out serum replacement Life Technologies 10828028 "KOSR"
Non-essential amino acids (NEAA) Life Technologies 11140050
b-mercaptoethanol, 55 mM solution Life Technologies 21985023
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich H1758
Fraction V, Bovine Serum Albumin Fisher Scientific BP1605
Ham's F12 Corning 10-080
N2 supplement Life Technologies 17502048
B27 supplement, no vitamin A Life Technologies 12587010
Stempro-34 (SP34) Life Technologies 10639011 "SP34"
Growth factor reduced Matrigel Corning 354230 "MAT"
L-absorbic acid Sigma-Aldrich A4403
Human serum transferrin Sigma-Aldrich 10652202001
Monothioglycerol (MTG) Sigma-Aldrich M6145
Collagenase B Roche 11088831001
Collagenase II Life Technologies 17101015
DNaseI Calbiochem 260913
Phosphate Buffered Saline (PBS) Life Technologies 14190144
bFGF R&D Systems 233-FB
BMP4 R&D Systems 314-BP
Activin A R&D Systems 338-AC
VEGF R&D Systems 293-VE
SCF R&D Systems 255-SC
IGF-1 R&D Systems 291-G1
IL-3 R&D Systems 203-IL
IL-6 R&D Systems 206-IL
IL-7 R&D Systems 207-IL
IL-11 R&D Systems 218-1L
TPO R&D Systems 288-TP
EPO Peprotech 100-64
Flt-3 ligand (FLT3-L) R&D Systems 308-FK
CHIR99021 Tocris 4423
IWP2 Tocris 3533
Angiotensin II Sigma-Aldrich A9525
Losartan Potassium Tocris 3798
CD4 PerCP Cy5.5 Clone RPA-T4 BD Biosciences 560650 Dilution 1:100; T cell assay
CD8 PE Clone RPA-T8 BD Biosciences 561950 Dilution 1:10; T cell assay
CD34 APC Clone 8G12 BD Biosciences 340441 Dilution 1:100; EHT assay
CD34 PE-Cy7 Clone 8G12 BD Biosciences 348801 Dilution 1:100; Hemogenic endothelium
CD43 FITC Clone 1G10 BD Biosciences 555475 Dilution 1:10; Hemogenic endothelium
CD45 APC-Cy7 Clone 2D1 BD Biosciences 557833 Dilution 1:50; T cell assay
CD45 eFluor450 Clone 2D1 BD Biosciences 642284 Dilution 1:50; EHT assay
CD56 APC Clone B159 BD Biosciences 555518 Dilution 1:20; T cell assay
CD73 PE Clone AD2 BD Biosciences 550257 Dilution 1:50; Hemogenic endothelium
CD184 APC Clone 12G5 BD Biosciences 555976 Dilution 1:50; Hemogenic endothelium
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) BD Biosciences 564907 Dilution 1:10,000; T cell assay
OP9 DL4 cells Holmes, R. and J.C. Zuniga-Pflucker. Cold Spring Harb Protoc, 2009. 2009(2): p. pdb prot5156
MethoCult H4034 Stemcell Technologies 4034 "MeC"
Milli-Q water purification system EMD Millipore
5% CO2 incubator Set at 37 C
Multigas incubator Set at 37 C, 5% CO2, 5% O2
6 well tissue culture plate Corning 353046
24 well tissue culture plate Corning 353226
6 well low-adherence tissue culture plate Corning 3471
24 well low-adherence tissue culture plate Corning 3473
35 mm tissue culture dishes Corning 353001
Blunt-end needle, 16 gauge Corning 305198
3 cc syringes Corning 309657
5 mL polypropylene test tube Corning 352063
5 mL polystyrene test tube Corning 352058
15 mL polypropylene conical Corning 430791
50 mL polypropylene conical Corning 430921
2 mL serological pipette Corning 357507
5 mL serological pipette Corning 4487
10 mL serological pipette Corning 4488
25 mL serological pipette Corning 4489
Cell scrapers Corning 353085
2.0 mL cryovials Corning 430488
5 mL test tube with 40 µM cell strainer Corning 352235
40 µM cell strainer Corning 352340
Cell culture centrifuge
Biosafety hood
FACS AriaII or equivalent
LSRii or equivalent
FlowJo software TreeStar
Water bath Set at 37 C
0.22 µM filtration system Corning
Autoclave
4 C refrigerator
-20 C Freezer
-80 C Freezer

Referencias

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Dege, C., Sturgeon, C. M. Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (129), e55196, doi:10.3791/55196 (2017).

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