Her presenterer vi menneskelige pluripotent stamceller (hPSC) kultur protokoller, som brukes til å skille hPSCs i CD34+ blodkreft progenitors. Denne metoden bruker scenen-spesifikke manipulering av kanoniske WNT signalisering til å angi celler eksklusivt til enten definitive eller primitive blodkreft programmet.
En av de viktigste målene for regenerativ medisin er generasjon og vedlikehold av blodkreft stamceller (HSCs) fra menneskelig pluripotent stamceller (hPSCs). Inntil nylig har arbeidet med å skille hPSCs i HSCs hovedsakelig generert blodkreft progenitors som mangler HSC potensial, og i stedet ligner plommesekken hematopoiesis. Disse resulterende blodkreft progenitors kan ha begrenset nytte for i vitro sykdom modellering av ulike voksen blodkreft lidelser, spesielt de av lymfoide linjen. Imidlertid har vi nylig beskrevet metoder for å generere erythro-myelo-lymfoide multilineage definitive blodkreft progenitors fra hPSCs med en fase-spesifikke rettet differensiering-protokollen, som vi skissere her. Gjennom enzymatisk avstandtagen for hPSCs på kjeller membran matrix-belagte plasticware dannes embryoid organer (EBs). EBs skilles til mesoderm av rekombinant BMP4, som er senere angitt til definitive blodkreft programmet GSK3β inhibitor, CHIR99021. Alternativt angis primitive hematopoiesis av den PORCN inhibitor, IWP2. Hematopoiesis er videre kjørt gjennom tillegg av rekombinant VEGF og støttende blodkreft cytokiner. Det resulterende blodkreft progenitors generert ved hjelp av denne metoden har potensial til å bli brukt for sykdom og utviklingsmessige modellering, i vitro.
Menneskelige pluripotent stamceller (hPSCs) defineres som omfatter både menneskelige embryonale stamceller (hESCs) og menneskelige indusert pluripotent stamceller (hiPSCs), og har den unike evnen til ikke bare gjennomgår selvtillit fornyelse under aktuelle vekst forhold, men også evnen til å skille ut alle celletyper fra tre bakterie lag: mesoderm og endoderm, og ektoderm1. På grunn av disse unike evner holde hPSCs store løftet for regenerativ medisin, sykdom modellering og cellen-basert behandling2. Mens flere celletyper har vært vellykket differensiert fra hPSCs, er en viktig utfordring i vitro spesifikasjon utelukkende voksen-lignende hPSC-avledet blodkreft stamceller (HSCs) og definitive blodkreft progenitors.
En sannsynlig barriere til utvikling av menneskelige HSCs fra hPSCs er det flere blodkreft programmer innenfor den menneskelige embryo3. Det første programmet som framgår, kalt “primitive hematopoiesis,” kommer i extraembryonic eggeplomme sac vevet og er best preget av forbigående produksjonen av erythroblast progenitors (EryP-CFC), makrofager og megakaryocytes. Spesielt dette programmet gi ikke opphav til HSCs eller gjør det gi opphav til T- og B lymfoide progenitors. Men plommesekken transiently gi opphav til begrenset definitive blodkreft progenitors, som erythro-myelogen stamfar (EMP4,5,6,7,8) og erythroid-mangelfull lymfoide primet multipotent stamfar (LMPP9). Men er verken Samkjøringsmodellen eller LMPPs fullt multipotent, eller i stand til HSC-lignende engraftment i voksen mottakere. I kontrast, senere i utviklingen, er klassisk definerte “definitive” blodkreft programmet angitt i regionen aorta-gonad-mesonephros av embryoet riktig, gir opphav til alle voksen blodkreft linjene, inkludert HSC. Spesifikasjon av disse intra embryonale definitive blodkreft cellene oppstår i et hakk avhengig mote, via en endothelial til blodkreft overgang fra hemogenic endotelet (han)3,10,11 ,12,13,14. Bortsett fra rekonstituering kapasitet, kan multilineage potensielle og hakk-avhengighet av disse cellene brukes til å skille disse definitive blodkreft progenitors fra at EMP og LMPP (omtalt i referanser3,13 ).
Forstå mechanism(s) styrer primitive og definitive blodkreft spesifikasjoner fra hPSCs trolig kritiske til at reproduserbar definitive blodkreft progenitors på tvers av en rekke hPSC linjer. Inntil nylig eksisterte hPSC differensiering protokoller som kunne skille multipotent primitive og definitive blodkreft progenitors ikke15,16,17,18, 19,20,21,22,23,24,25. Mange tilnærminger bruker fosterets bovin serum (FBS) og/eller stromal co kultur først beskrevet blodkreft potensialet i hPSC differensiering, med blandinger av primitive og definitive blodkreft potensielle15,16, 17,19,22,23,25. Videre, mange serum-free blodkreft protokoller har beskrevet kravene signal for spesifisering av mesoderm fra hPSCs som havner blodkreft potensielle18,20,21, 24. som disse metodene fortsatt ga opphav til heterogene blandinger av begge programmene, deres bruk i kliniske applikasjoner og forståelse utviklingsmessige mekanismer kan imidlertid være begrenset.
Vi har nylig bygget på disse studiene, har skissert scenen-spesifikke signal kravene til ACTIVIN/NODAL og WNT signalering i primitive og definitive blodkreft spesifikasjonen hPSC-avledet mesoderm18,26 . Sistnevnte var spesielt unik, som bruken av scenen-spesifikke WNT signal manipulasjon gjør at du kan utelukkende primitive eller utelukkende definitive blodkreft progenitors26. Under mesoderm-spesifikasjonen, hemming av kanoniske WNT signalnettverk med PORCN hemmer IWP2 resulterer i spesifikasjon av CD43+ EryP-CFC og myelogen progenitors, med ingen synlig lymfoide potensial. I skarp kontrast stimulering av kanoniske WNT signalnettverk med den GSK3β inhibitor, CHIR99021, under samme scene av differensiering resulterte i den komplette fraværet av synlig CD43+ EryP-CFC, mens samtidig fører til den spesifikasjon av CD34+CD43− han. Denne befolkningen hadde myelogen, HBG-uttrykke erythroid og T-lymfoide potensialet. Etterfølgende analyser identifisert dette var han som manglet uttrykket CD7327,28 og CD18428og dens blodkreft potensial HAKK-avhengige28. Videre, én celle klonal analyser har vist at disse definitive blodkreft linjene kan utledes fra multipotent enkeltceller28. Sammen indikerer disse studier at scenen-spesifikke WNT signalering manipulasjon kan angi rent primitive blodkreft progenitors, eller multipotent HAKK-avhengige definitive blodkreft progenitors.
Her skissere vi vår Differensieringsstrategi som gir utelukkende primitive eller definitive blodkreft progenitors, via manipulering av kanoniske WNT signalering under mesodermal mønstre, og deres nedstrøms blodkreft avstamning analyser. Denne protokollen er av stor verdi for etterforskerne som er interessert i produksjonen av primitive eller definitive blodkreft progenitors fra hPSCs for regenerativ medisin programmer.
Denne protokollen beskriver en rask, serum-free, stroma-fri metode for differensiering av primitive eller definitive blodkreft progenitors. Mesodermal spesifikasjon av primitive eller definitive blodkreft progenitors kan bli pålitelig oppnådd med våre protokollen, som unikt utnytter lite molekyl hemmere kanoniske WNT signalnettverk. Scenen-spesifikke WNT aktivering av GSK3β hemmer CHIR9902133 gir opphav til definitive blodkreft mesoderm, mens WNT hemming av PORCN hemmer IWP23…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet har blitt støttet av Institutt for indremedisin, divisjon av hematologi, Washington University School of Medicine. CD ble støttet av T32HL007088 fra nasjonale hjerte, lunge og blod Institute. CMS ble støttet av en American Society for hematologi Scholar Award.
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMD) | Corning | 10-016 | |
Fetal Bovine Serum (FBS), ES cell rated | Gemini Bioproducts | 100-500 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30396.03 | |
L-glutamine, 200 mM solution | Life Technologies | 25030-081 | |
Penicillin-streptomycin | Life Technologies | 15070-063 | |
0.25% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200056 | |
0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300054 | |
Gelatin, porcine skin, Type A | Sigma-Aldrich | G1890 | |
Alpha-MEM | Life Technologies | 12000-022 | |
DMEM-F12 | Corning | 10-092-CV | |
Knock-out serum replacement | Life Technologies | 10828028 | "KOSR" |
Non-essential amino acids (NEAA) | Life Technologies | 11140050 | |
b-mercaptoethanol, 55 mM solution | Life Technologies | 21985023 | |
Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H1758 | |
Fraction V, Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1605 | |
Ham's F12 | Corning | 10-080 | |
N2 supplement | Life Technologies | 17502048 | |
B27 supplement, no vitamin A | Life Technologies | 12587010 | |
Stempro-34 (SP34) | Life Technologies | 10639011 | "SP34" |
Growth factor reduced Matrigel | Corning | 354230 | "MAT" |
L-absorbic acid | Sigma-Aldrich | A4403 | |
Human serum transferrin | Sigma-Aldrich | 10652202001 | |
Monothioglycerol (MTG) | Sigma-Aldrich | M6145 | |
Collagenase B | Roche | 11088831001 | |
Collagenase II | Life Technologies | 17101015 | |
DNaseI | Calbiochem | 260913 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Life Technologies | 14190144 | |
bFGF | R&D Systems | 233-FB | |
BMP4 | R&D Systems | 314-BP | |
Activin A | R&D Systems | 338-AC | |
VEGF | R&D Systems | 293-VE | |
SCF | R&D Systems | 255-SC | |
IGF-1 | R&D Systems | 291-G1 | |
IL-3 | R&D Systems | 203-IL | |
IL-6 | R&D Systems | 206-IL | |
IL-7 | R&D Systems | 207-IL | |
IL-11 | R&D Systems | 218-1L | |
TPO | R&D Systems | 288-TP | |
EPO | Peprotech | 100-64 | |
Flt-3 ligand (FLT3-L) | R&D Systems | 308-FK | |
CHIR99021 | Tocris | 4423 | |
IWP2 | Tocris | 3533 | |
Angiotensin II | Sigma-Aldrich | A9525 | |
Losartan Potassium | Tocris | 3798 | |
CD4 PerCP Cy5.5 Clone RPA-T4 | BD Biosciences | 560650 | Dilution 1:100; T cell assay |
CD8 PE Clone RPA-T8 | BD Biosciences | 561950 | Dilution 1:10; T cell assay |
CD34 APC Clone 8G12 | BD Biosciences | 340441 | Dilution 1:100; EHT assay |
CD34 PE-Cy7 Clone 8G12 | BD Biosciences | 348801 | Dilution 1:100; Hemogenic endothelium |
CD43 FITC Clone 1G10 | BD Biosciences | 555475 | Dilution 1:10; Hemogenic endothelium |
CD45 APC-Cy7 Clone 2D1 | BD Biosciences | 557833 | Dilution 1:50; T cell assay |
CD45 eFluor450 Clone 2D1 | BD Biosciences | 642284 | Dilution 1:50; EHT assay |
CD56 APC Clone B159 | BD Biosciences | 555518 | Dilution 1:20; T cell assay |
CD73 PE Clone AD2 | BD Biosciences | 550257 | Dilution 1:50; Hemogenic endothelium |
CD184 APC Clone 12G5 | BD Biosciences | 555976 | Dilution 1:50; Hemogenic endothelium |
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | BD Biosciences | 564907 | Dilution 1:10,000; T cell assay |
OP9 DL4 cells | Holmes, R. and J.C. Zuniga-Pflucker. Cold Spring Harb Protoc, 2009. 2009(2): p. pdb prot5156 | ||
MethoCult H4034 | Stemcell Technologies | 4034 | "MeC" |
Milli-Q water purification system | EMD Millipore | ||
5% CO2 incubator | Set at 37 C | ||
Multigas incubator | Set at 37 C, 5% CO2, 5% O2 | ||
6 well tissue culture plate | Corning | 353046 | |
24 well tissue culture plate | Corning | 353226 | |
6 well low-adherence tissue culture plate | Corning | 3471 | |
24 well low-adherence tissue culture plate | Corning | 3473 | |
35 mm tissue culture dishes | Corning | 353001 | |
Blunt-end needle, 16 gauge | Corning | 305198 | |
3 cc syringes | Corning | 309657 | |
5 mL polypropylene test tube | Corning | 352063 | |
5 mL polystyrene test tube | Corning | 352058 | |
15 mL polypropylene conical | Corning | 430791 | |
50 mL polypropylene conical | Corning | 430921 | |
2 mL serological pipette | Corning | 357507 | |
5 mL serological pipette | Corning | 4487 | |
10 mL serological pipette | Corning | 4488 | |
25 mL serological pipette | Corning | 4489 | |
Cell scrapers | Corning | 353085 | |
2.0 mL cryovials | Corning | 430488 | |
5 mL test tube with 40 µM cell strainer | Corning | 352235 | |
40 µM cell strainer | Corning | 352340 | |
Cell culture centrifuge | |||
Biosafety hood | |||
FACS AriaII or equivalent | |||
LSRii or equivalent | |||
FlowJo software | TreeStar | ||
Water bath | Set at 37 C | ||
0.22 µM filtration system | Corning | ||
Autoclave | |||
4 C refrigerator | |||
-20 C Freezer | |||
-80 C Freezer |