A method for establishing lung infections in immunocompetent rodents is described. With proficiency, this method can be performed quickly and easily to induce stable infection with many isolates of S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae and A. baumannii.
候选抗菌治疗功效必须在感染的动物模型中表现为发现和开发过程的一部分,优选地在其模拟预期的临床适应症的模型。描述了一种用于在免疫大鼠和小鼠诱导健壮的肺部感染的方法,它允许对治疗引起的肺炎链球菌 , 流感嗜血杆菌 , 绿脓杆菌 , 肺炎克雷伯或鲍曼不动杆菌严重肺炎的模型的评估。动物麻醉,并基于琼脂接种物深存入通过非手术气管插管肺。所得感染是一致的,可重复的,并且为至少48小时的稳定和高达96小时对大多数的菌株。已经与市售抗菌剂的研究表明良好的相关体内效力和体外敏感性,并测定药物动力学/药效目标之间的一致性在这个模型中和临床认可目标已经观察到。虽然有学习技术时的初始时间的投入,它可以快速和有效地一旦熟练实现执行。该模型的优点包括的中性粒细胞减少需求消除,提高了稳定性和可重复性,学习更多的病原体和隔离,在研究设计和建立一个具有挑战性的感染更高的灵活性在免疫活性宿主的能力。
在评估感染的动物模型中潜在的候选药物的疗效抗菌药物发现过程的关键组成部分。 体内功效研究用于提供重要的数据的决策横跨发现努力的跨度,从阐明结构-活性关系(SAR),并通过确定的药物代谢动力学,药效学(PK / PD)优化引线化学系列化合物的特性和支承剂量选择为临床开发和监管部门批准。众多动物感染模型在文献中对这些目的描述。其中最常见和广泛使用的模型是中性粒细胞减少小鼠大腿感染,这是由鹰1,2率先后来由Vogelman和克雷格3,4扩大。这种模式是非常宝贵的支持细菌药敏断点的决心和提供PK / PD指标来指导人类的剂量。有许多考试普莱斯这个模型的预测能力已经被证明4-7。然而,大腿感染模型的缺点之一是缺乏直接对肺部感染的相关性。现在有一种更加强调感染的动物模型的感染人类的站点的站点匹配;因此,为了研究肺炎的治疗化合物,理想的是利用动物肺部感染模型。
已经描述和用于抗菌功效研究包括鼻内吸入,通过口咽路线抽吸,气雾剂曝光和外科气管内接种8用于诱导在实验室动物的肺部感染的方法。在许多情况下,将动物(特别是小鼠)必须首先,以实现一个坚固的肺部感染呈现中性粒细胞减少。尽管这样严重免疫状态,从而产生可行的感染在啮齿类动物的细菌病原体和应变数量有限。例如,它可以是难以成功建立流感嗜血杆菌或鲍曼不动杆菌在肺炎模型9,10,和甚至更致命的病原体,如肺炎链球菌,铜绿假单胞菌和肺炎克雷伯氏菌,可以带来挑战11-13。
1991年,史密斯在其感染是由通过一个简单的非手术气管插管法直接14灌输细菌进入肺部免疫建立大鼠断乳描述的肺部感染模型。浆果等 。后来修改了感染小鼠的15方法。使用基于琼脂接种物,这种接种技术诱导既免疫大鼠和小鼠肺炎链球菌,流感嗜血,肺炎克雷伯,绿脓杆菌和鲍曼不动杆菌健壮肺部感染。它是适合于广泛的菌株,包括那些窝藏各种抗蚀剂ANCE因素和那些不通过其他途径接种产生一个可行的感染。它也允许在免疫动物来确定功效,条件比用于患者群体是不严重免疫传统中性粒细胞减少小鼠模型更相关。在多个病原体和分离该模型的一致性和可靠性使得它非常适合抗菌功效的研究。
对于复制本感染模型最优的成功,以下补充建议应予以考虑。在一项研究中在体内的利用之前的3倍-新菌株毒力可以传代2得到增强。冷冻细菌股票应始终从主体内衍生来源与编制从原来的几段越好,重新冻结或解冻的股票重用气馁。使用最近从患者恢复肺炎临床分离,和/或准备在数生长期的文化也可以帮助改善建立感染。一个五倍稀释到琼脂( 例如 2毫升盐水悬浮液加入到8mL的琼脂)可以用来代替的十倍,以增加细菌接种物,并接种物体积可以调节基于动物的大小( 例如 200微升/动物通常接种到250克只)。之前加入盐水细菌悬浮液进琼脂( 即在步骤2.3),细菌密度可以预测或通过视觉检查,麦克法兰标准或光密度测量估计。是有帮助的熟悉的体外生长特性的每个之前的体内实验进行隔离。一致性在生长和处理能为任何给定的分离的细菌密度的最准确的估计。从所描述的那些,如替代媒体和组织均化不同标准的微生物学方法,可以适当使用用于制备接种物,并从感染组织列举细菌。
强烈建议准备或实验前融化的琼脂白天和设定为50℃,一个单独的水浴中过夜存放。这将简化流程,并帮助防范琼脂处于感染时太热。 41温度 – 42℃,达到maintai之间的良好平衡宁琼脂在液体状态而不为短期的细菌生存太热。作为一种可能的替代营养琼脂,贵金属琼脂已成功在一些实验中使用。琼脂接种物的一管通常是足够用于整个实验(和建议),但多个管可用于感染大量的动物来制备( 例如 ,大于60),或者当感染过程需要超过30更长- 45 min如果多个接种管是必需的,盐水细菌悬浮液添加到琼脂每个管,因为它是需要的。这减少了细菌存活和/或健身将由长期暴露的影响,以在接种前的高温下的风险。应当注意的是,使用多种菌管还可能需要额外的动物的随机化过程。只要有可能,从相同的接种物制剂感染所有的动物。建议的实验的大小调整到熟练的当前级别与德chnique。
一个熟练的科学家可以插管,在不到30秒的接种动物和接种长达5 -每批次6只动物( 即一个注射器充满琼脂接种)。对于那些学习技术,速度是琼脂重要开始固化;然而,接种的精确放置是更重要的。每批次1或2只动物开始,并且随着技术变得更加熟悉。动物继续插管呼吸;因而,对于接种的时间窗口取决于动物从异氟烷,这应该是大约2如何迅速恢复 – 3分钟。过程中所唤起的动物可以重新麻醉并试图在第二时间,但它不建议如此反复做。在第一次尝试成功的接种预期在动物中的几乎100%的一次熟练度实现。注意,它是比较容易首先用大鼠的学习技术;小鼠更细腻,也更小LS更容易与琼脂凝固堵塞如果不迅速操纵。预变暖注射器,管道和盐水以及保持在一个温暖的(不热)表面上的插管装置,例如在低设置一个加热垫,可以帮助防止琼脂凝固。当学习的技术中,它也有利于用深色染料(如浓缩亚甲蓝)代替琼脂的细菌悬浮液来实施接种的正确放置。执行该过程的描述,但安乐死动物立即染料接种以下(不使动物麻醉并实施安乐死之间恢复)。解剖,以确定其中的染料已经被放置,并相应地调整技术。
此模型中的主要终点是CFU从感染肺部。生存不是细菌负担一个很好的指标,而不是推荐端点。对于功效研究,所建议的N是5 – 每组6只动物,因为这是predicted可检测≥1日志组之间10 CFU差异至少有90%的电力。动物可在基团被感染,使得笼配合保持在一起,或真正的随机化过程可以遵循。需要注意的是,如果基团被笼分配,基团应当以随机顺序感染感染最后结束的研究生长对照(确认细菌存活/健身并不受的时间暴露于高温下的长度在水浴)。没有数据截尾的方法应该是必要的,并且没有推荐使用立即除去该已明显误接种在研究开始时(之前的任何治疗开始)的任何动物的除外。被之前的研究结束时处死的动物应该采样并包括在数据集除非排除有效的原因是前瞻性鉴定结果( 即无关的感染或治疗事件)。药物残留可能AFF等一些样品,并在所有的体内感染模型的一个重要的考虑因素。如果一个化合物给出频繁,靠近安乐死的时间,或具有长的半衰期,也可以是存在于所述组织匀浆以足够高的浓度,以继续在细菌枚举过程杀死细菌体外 (稀释和电镀过夜温育过程中在琼脂平板的样品或)。为了防止这种情况,活性炭和/或其降解的活性分子,而不伤害细菌细胞可以添加到之前均化样品中的添加剂。其它方法包括离心样品以除去大部分的活性化合物(应留在上清液)的和使用不同的稀释和电镀方案充分稀释的活性化合物到非抑制浓度。
如由图2中所示的例子中,该模型成功我nduces在啮齿类动物肺部感染具有广泛的生物体包括那些不能很好地在其它模式( 例如流感嗜血杆菌 )生长的。这些感染是一致的和可重复的,从而减少了实验需要,由于进行多次,以模型故障和/或性能差与给定的分离的可能性。虽然动物是免疫活性,它们无法迅速解决感染,如果在所有。这允许在研究长度增加的灵活性,因为许多分离株通过至少96小时保持的可行感染,而不需要重复注射以维持中性粒细胞减少。研究在免疫动物的抗菌功效的潜在益处已如前所述20,21,并且有证据表明,对某些化合物( 如恶唑烷酮),从非中性白细胞减少症的啮齿动物的数据可以更精确地与这些呈现中性粒细胞减少相比预测人类接触的目标5。 T的多功能工具他模型是表现在图3和4及表1和2这些研究已与该模型生成的,以支持引线优化努力16,17的大集合公布和未公布的数据,22-24的一部分,用于比较并提出了人类给药确认服法19,25-29和PK / PD表征18,30-32。而这种模式是最初更复杂的鼻内吸入法相比进行,有如上所述的许多好处。随着实践和日常使用,这些技术应该成为易于执行。
它可能在一些研究中,在基线细菌负荷比通常针对其他肺部感染模型下加以注意。这是由于在很大程度上所需稀释成琼脂和小挑战体积,尤其是在小鼠。然而,还应当注意该细菌生长被认为在即使当初始负担是相当低的所有情况。目标基线细菌负荷是6至6.5日志10 CFU /肺(6.8至7.3日志10单位/克,基于平均肺重量的小鼠组织的),它对应于在人类患者中,估计重症肺炎33密度。较高的基线负担可以通过进一步浓缩细菌接种物或者通过延缓化合物给药开始,以允许附加的细菌生长来实现;然而,越来越多的挑战负荷过多,可导致严重的异常和急性疾病( 即死亡不到24小时),这是难治所有抗菌治疗,无论敏感性。虽然接种最初放置优先到动物的左肺,感染通常传遍两肺。进肺部疾病,细菌对其他器官的传播,并最终发病率往往是OBSERVED与肺炎链球菌,肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌 。有趣的是,与流感嗜血杆菌和鲍曼不动杆菌感染通常更包含的,很少导致死亡在规定的细菌接种。
从这个模型得到疗效结果与体外药敏简介以及定义PK / PD的目标密切相关。在细菌负荷减少例行所考虑易受剂被测试菌株观察到的,而那些被认为是耐展览高于基线16,17,19,24-29无变化或细菌生长。已在大鼠评价两个喹诺酮类和使用此模型32大环内酯类研究显示与基线与和,更重要的是在中性粒细胞减少小鼠中确定的目标相关联相比,对于所要求的PK / PD目标1登录肺炎链球菌 10减少,具有社区获得性细菌pneum临床指标onia 6,7,34,35。 Gepotidacin,一种新的机制抗生素,是对多个肺炎链球菌测试并需要一个类似的PK / PD目标对该肺部感染模型31 1-日志10减少作为在中性粒细胞减少大腿模型1日志10还原所需36时肺部穿透被考虑(对文件数据)。同样,在小鼠对绿脓杆菌 GSK2251052确定的PK / PD目标是为瘀,1年和2记录此肺模型30和中性粒细胞减少大腿感染模型之间的CFU降低10时一致穿透肺部被认为是37,38 。使用鼻内接种是穷人一个中性粒细胞减少肺部感染模型的相关性;然而,GSK2251052没有产生比在这项研究中38静态响应多。作为与6日志相比,这可能是归因于较高的细菌接种物,这是8日志10 CFU /小鼠<sub> 10 CFU /鼠标在中性粒细胞减少大腿37和气管插管30款。如这个数据的收集为基准关键的,因为它允许用现有的模型和临床数据相关的直接比较,以评估所述平移预测能力。更广泛地使用气管内插管肺部感染模型将这些类型的分析提供额外的数据。
有此免疫肺炎模型的一些限制。首先,它不能很好地适合于由于高细菌接种物通常需要在太严重感染这样的研究结果评价自发耐药性的出现。以下企图达到7或8的日志10 CFU在基线,快速发病率已经观察到的细菌负担( 即动物,在不到24小时变得垂死)尽管接种的彻底清洗以除去(在文件中的数据)预先存在的毒素。它可能通过使用较大的啮齿动物来克服这个问题。鼠,尤其较重大鼠(> 250克),似乎更好地耐受更高的接种小鼠相比,并且可以是适合于这些类型的研究。第二个限制是,使用琼脂作为感染增强剂可以排除使用用于某些宿主的评价模型:病原体相互作用。据认为,琼脂提供受保护的焦点,直到感染肺部内完全建立。有可能提供在盐水中,而不是琼脂,以帮助克服这个问题的接种物然而,应当注意的是,这只会产生感染与某些菌株。第三,要成为精通技术需要一个陡峭的学习曲线。该过程可以是微妙的,特别是在小鼠。这是很容易的金属套管误放入食道,并且过大的力可能导致要么食道或气管穿刺。接种仔细放置也要求或动物可能根本无法恢复或得不到充分的感染。然而,有耐心和毅力,可以成为高度熟练和快速执行的技术,顺利和准确。
通过去除中性粒细胞减少的要求,增加了鲁棒性和再现性,允许调查研究更病原体和分离,提高实验设计的灵活性,并提供一个具有挑战性的感染来表征药效学肺炎,这种免疫活性的肺部感染模型增加重大价值的抗生素发现社区。增加使用这种模式通过额外的调查将有助于提供必要的基准为它赢得更广泛的接受和继续提供适当的解释的支持信息。
The authors have nothing to disclose.
JH要感谢,感谢导师,朋友和前经理瓦莱丽·贝瑞的第一个教我们这种模式;和加里Woodnutt,谁教我们的基础,我们的灵感抗菌PK / PD领域的承诺。所有的作者要感谢大卫·佩恩对他的支持和赞赏我们的科学。我们要感谢我们谁使用这些方法,尤其是皮特DeMarsh,罗布·斯特劳布,罗尼页面和尼莉莎西蒙生成数据的身体贡献体内微生物的同事前者。最后,我们要感谢我们的体外微生物同事们的援助,特别是提供我们所要求的MIC(麦克洛斯基琳,乔什西和莎朗敏);并为我们的临床微生物的团队谁提供专家建议和支持(琳达米勒,妮可Scangarella,阿曼和德博拉·巴特勒)。
TSA II Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood | Becton Dickinson and Company | 4321261 | |
Chocolate II Agar | Becton Dickinson and Company | 4321267 | |
BBL Brain Heart Infusion Broth Modified | Becton Dickinson and Company | 299070 | |
BBL Trypticase Soy Broth with 20% Glycerol | Becton Dickinson and Company | 297808 | storage media for frozen stock |
Inoculating loop | Nunc | 251586 | |
0.9% Sodium Chloride, USP | Baxter Healthcare Corporation | NDC 0338-0048-04 | |
Difco Nutrient Agar | Becton Dickinson and Company | 213000 | |
30 ml free standing centrifuge tube with cap | EverGreen Scientific | 222-3530-G80 | |
50 ml Polypropylene Conical Tube 30 x115mm | Falcon, a Corning Brand | 352070 | |
14 ml Polypropylene Round-Bottom Tube 17 x 100mm | Falcon, a Corning Brand | 352059 | |
Guide Tool | Intek Services Ltd | GT01 | custom-made metal cannula for rats |
90' Portex tubing | SAI | POR-080-100 | plastic cannula for rats |
1 ml TB syringe slip tip | Becton Dickinson and Company | 309659 | |
PrecisionGlide Needle 25G x 5/8 | Becton Dickinson and Company | 305122 | |
Animal feeding needle – straight 20×3" 2-1/4 | Popper and Sons, Inc | 7903 | used to create metal cannula for mice |
Intramedic polyethylene tubing | Clay Adams brand – Becton Dickinson and Company | 427401 | plastic cannula for mouse |
75 TN 5.0ul syringe 26s/2"/2 | Hamilton | 87930 | HPLC glass injection syringe |
Pyrex tube, culture 25×150 screwcap with rubber liner | Corning | 9825-25 | to autoclave/store metal cannulae |
70% isopropyl alcohol | Vi-Jon (Swan) | NDC 0869-0810-43 | |
Isoflurane, USP | Piramal Healthcare | NDC 66794-013-10 | |
Stomacher | Seward | Stomacher80 | |
Stomacher 80 classic bags | Seward | BA6040 | |
Assay plate, 96 well, round bottom | Costar, Corning Inc | 3795 | optional, for serial diluting |
Blood Omni Plates | Hardy | #A127 | optional, rectangular blood plates |