Un modelo de neumonía en inmunocompetentes robusta roedores para evaluar Eficacia antibacteriana contra<i> S. pneumoniae</i>,<i> H. influenzae</i>,<i> K. pneumoniae</i>,<em> P. aeruginosa</em> o<em> A. baumannii</em
Summary
A method for establishing lung infections in immunocompetent rodents is described. With proficiency, this method can be performed quickly and easily to induce stable infection with many isolates of S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae and A. baumannii.
Abstract
La eficacia de los tratamientos antibacterianos candidato debe ser demostrada en modelos animales de infección como parte del proceso de descubrimiento y desarrollo, de preferencia en modelos que imitan la indicación clínica deseada. Un método para inducir infecciones pulmonares robustos en ratas y ratones inmunocompetentes se describe que permite la evaluación de los tratamientos en un modelo de neumonía grave causada por S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae o A. baumannii. Los animales se anestesiaron, y un inóculo a base de agar se deposita profundamente en el pulmón a través de la intubación intratraqueal no quirúrgica. La infección resultante es consistente, reproducible, y estable durante al menos 48 h y hasta 96 h para la mayoría de los aislados. Los estudios con antibacterianos comercializados han demostrado una buena correlación entre la eficacia in vivo e in vitro de susceptibilidad, y la concordancia entre farmacocinéticos / farmacodinámicos objetivos determinadaen este modelo y los objetivos clínicamente aceptados se ha observado. A pesar de que es una inversión de tiempo inicial en el aprendizaje de la técnica, se puede llevar a cabo con rapidez y eficacia una vez que se logra el dominio. Beneficios del modelo incluyen la eliminación del requisito de neutropenia, mayor robustez y reproducibilidad, capacidad para estudiar más patógenos y aísla, una mayor flexibilidad en el diseño del estudio y el establecimiento de una infección difícil en un huésped inmunocompetente.
Introduction
La evaluación de la eficacia de los fármacos candidatos potenciales en modelos animales de infección es un componente crítico del proceso de descubrimiento de fármacos antibacterianos. Los estudios in vivo proporcionan datos importantes para la toma de decisiones en el transcurso de los esfuerzos de descubrimiento, de elucidar las relaciones estructura-actividad (SAR) y la optimización de serie química iniciativa a través de la determinación farmacocinético-farmacodinámico (PK / PD) características de los compuestos y el apoyo a la dosis para desarrollo clínico y la aprobación reglamentaria. Numerosos modelos animales de infección se describen en la literatura para estos fines. Uno de los modelos más comunes y ampliamente utilizados es la infección neutropénica muslo del ratón, el cual fue iniciado por Eagle 1, 2 y posteriormente expandido en Vogelman y Craig 3, 4. Este modelo ha sido muy valioso para apoyar la determinación de la susceptibilidad de interrupción bacterianas y para proporcionar objetivos PK / PD guía para la dosificación humana. Hay muchos examenples donde la capacidad de predicción de este modelo se ha demostrado 4-7. Sin embargo, uno de los inconvenientes del modelo de infección del muslo es la falta de relevancia directa para las infecciones pulmonares. Ahora hay un mayor énfasis en la búsqueda de la localización de la infección en modelos animales para el sitio de la infección en los seres humanos; y por lo tanto, para estudiar compuestos para el tratamiento de la neumonía, es ideal para utilizar un modelo de infección pulmonar en los animales.
Varios métodos para inducir infecciones pulmonares en los animales de laboratorio se han descrito y utilizado para los estudios de eficacia antibacteriana incluyendo inhalación intranasal, la aspiración a través de la ruta de la orofaringe, la exposición al aerosol, y la inoculación intratraqueal quirúrgica 8. En muchos casos, los animales (especialmente ratones) primero deben ser prestados neutropénica a fin de lograr una infección pulmonar robusto. A pesar de este estado gravemente inmunodeprimidos, el número de patógenos bacterianos y cepas que producen infecciones viables en roedores eslimitado. Por ejemplo, puede ser difícil de establecer con éxito Haemophilus influenzae o Acinetobacter baumannii en modelos neumonía 9, 10, e incluso más virulenta patógenos, tales como Streptococcus pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa y Klebsiella pneumoniae, puede plantear problemas 11-13.
En 1991, Smith describe un modelo de infección pulmonar en ratas destetadas inmunocompetentes en los que la infección se estableció mediante la instilación de bacterias directamente a los pulmones a través de un simple método de intubación intratraqueal no quirúrgica 14. Berry et al. posteriormente modificado el método para infectar a los ratones 15. El uso de un inóculo a base de agar, esta técnica de inoculación induce infecciones pulmonares robustas en tanto en ratas inmunocompetentes y ratones con S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa y A. baumannii. Es susceptible a una amplia gama de aislados, incluyendo aquellos que alberga varios resistendeterminantes ANCE y aquellos que no producen una infección viable a través de otras vías de inoculación. También permite a la eficacia que se determinará en animales inmunocompetentes, una condición que es más relevante que el modelo tradicional de ratón neutropénico para poblaciones de pacientes que no están severamente inmunocomprometidos. La consistencia y fiabilidad de este modelo a través de múltiples patógenos y aislamientos hace que sea muy adecuado para estudios de eficacia antibacteriana.
Protocol
Representative Results
Discussion
Para obtener resultados óptimos en la reproducción de este modelo de infección, se deben considerar las siguientes sugerencias adicionales. La virulencia de los nuevos aislados se puede mejorar haciendo pasar 2 – 3 veces en vivo antes de la utilización en un estudio. Poblaciones bacterianas congeladas siempre deben prepararse a partir de una fuente primaria -derivado in vivo con el menor número de pases como sea posible a partir de la original, y volver a congelar o reutilización de Stock descongelado no se recomienda. El uso de aislados clínicos recientes recuperados de pacientes con neumonía y / o preparación de los cultivos en fase logarítmica de crecimiento también puede ayudar a mejorar el establecimiento de la infección. Una dilución de cinco veces en el agar (por ejemplo, 2 ml de suspensión salina añadió a 8 ml de agar) se puede utilizar en lugar de diez veces para aumentar el inóculo bacteriano, y el volumen de inóculo se puede ajustar en función del tamaño del animal (por ejemplo, 200 l / animal generalmente se inocularon en 250 g de ratas). Antes de la adición de la suspensión bacteriana solución salina en elagar (es decir, en el paso 2.3), la densidad bacteriana se puede predecir o estimar mediante inspección visual, las normas de MacFarland o mediciones de densidad óptica. Es útil para familiarizarse con las características de crecimiento in vitro para cada aislamiento antes de realizar los experimentos in vivo. La consistencia en el crecimiento y la manipulación permite la estimación más precisa de la densidad bacteriana de cualquier muestra dada. métodos microbiológicos estándar que difieren de los descritos, tales como los medios de comunicación y homogeneizadores de tejidos alternativa, se pueden utilizar según sea apropiado para la preparación de inóculos y la enumeración de las bacterias a partir de tejidos infectados.
Es muy recomendable para preparar o fundir el agar el día antes del experimento y almacenarla durante la noche en un baño de agua separada se establece en 50 ° C. Esto simplificará el proceso y ayudar a proteger contra el agar ser demasiado caliente en el momento de la infección. Una temperatura del 41 – 42 ° C logra un buen equilibrio entre el manteniNing el agar en estado líquido sin ser demasiado caliente para la supervivencia bacteriana a corto plazo. Como una posible alternativa a agar nutritivo, agar noble se ha utilizado con éxito en algunos experimentos. Un tubo de inóculo agar es por lo general suficiente para todo un experimento (y se recomienda), pero múltiples tubos se puede preparar para infectar un gran número de animales (por ejemplo, más de 60) o cuando el proceso de infectar tarda más de 30 – 45 min Si se requieren múltiples tubos de inóculo, agregar la suspensión bacteriana solución salina a cada tubo de agar como se necesita. Esto reduce el riesgo de que la supervivencia y / o idoneidad bacteriana se verán afectados por la exposición prolongada a una temperatura elevada antes de la inoculación. Cabe señalar que el uso de múltiples tubos de inóculo también pueden requerir procedimientos adicionales de animales de aleatorización. Siempre que sea posible, infectar a todos los animales de la misma preparación del inóculo. Se recomienda para adaptar el tamaño de experimentos para el nivel actual de competencia con el technique.
Un científico experto puede intubar e inocular un animal en menos de 30 s y inocular hasta 5 – 6 animales por lotes (es decir, con una jeringa llena de inóculo agar). Para aquellos que están aprendiendo la técnica, la velocidad es importante, ya que el agar se empezará a solidificar; sin embargo, la colocación exacta del inóculo es más importante. Comience con 1 o 2 animales por lote, y aumentar a medida que la técnica se hace más familiar. Los animales continúan a respirar durante la intubación; Por lo tanto, la ventana de tiempo para la inoculación depende de la rapidez con que el animal se recupere de isoflurano, que debe ser de aproximadamente 2 – 3 min. Los animales que despiertan durante el proceso pueden ser re-anestesiados e intentaron una segunda vez, pero no se recomienda hacerlo en varias ocasiones. Se espera que la inoculación con éxito en el primer intento en casi el 100% de los animales una vez que se logra el dominio. Tenga en cuenta que es más fácil para aprender la técnica usando ratas primera; Los ratones son más delicados y cuanto menor sea demasiadols son más propensos a la obstrucción con agar solidificado si no manipulado rápidamente. jeringas pre-calentamiento, tubos y salinas, así como mantener el dispositivo de intubación en una superficie tibia (no caliente), tal como una almohadilla térmica a baja temperatura, pueden ayudar a prevenir la solidificación del agar. Cuando el aprendizaje de la técnica, también es útil para practicar la colocación adecuada del inóculo usando un colorante de color oscuro (tal como azul de metileno concentrado) en lugar de la suspensión bacteriana en agar. Realizar el procedimiento como se describe, pero la eutanasia a los animales inmediatamente después de la inoculación del colorante (no permitir que el animal se recupere entre la anestesia y la eutanasia). Diseccionar para determinar donde el colorante se ha colocado, y ajustar en consecuencia la técnica.
El criterio de valoración principal de este modelo es CFU de los pulmones infectados. La supervivencia no es un buen indicador de la carga bacteriana y no es un punto final recomendado. Para los estudios de eficacia, la N sugerido es de 5 – 6 animales por grupo, ya que es predicted para detectar ≥1 log 10 CFU diferencias entre los grupos con poder por lo menos 90%. Los animales pueden ser infectados en grupos de tal manera que sus compañeros de jaula permanecen juntos, o un verdadero proceso de asignación al azar pueden ser seguidos. Tenga en cuenta que si los grupos son asignados por jaula, los grupos deben ser infectados en una secuencia aleatoria con los controles de crecimiento de fin de estudio infectadas último (para confirmar que la supervivencia bacteriana / aptitud no se vio afectada por la longitud de tiempo de exposición a una temperatura elevada en el baño de agua). No hay métodos de censura datos deben ser necesario, y ninguno se recomiendan con la excepción de la eliminación inmediata de cualquier animal que ha sido obviamente mis-inoculadas en el comienzo del estudio (antes del inicio de cualquier tratamiento). Los animales que son sacrificados antes del final del estudio se tomarán muestras y los resultados incluidos en el conjunto de datos a menos que una razón válida para la exclusión se identificó de forma prospectiva (es decir, un evento no relacionado con la infección o tratamiento). arrastre medicamento puede affect algunas muestras y es una consideración importante en todos los modelos de infección in vivo. Si se administra un compuesto de frecuencia, cerca del momento de la eutanasia o tiene una larga vida media, puede estar presente en el homogeneizado de tejido en una concentración lo suficientemente alta para continuar matar las bacterias ex vivo durante el proceso de enumeración de bacterias (dilución y el chapado de las muestras o en las placas de agar durante la incubación durante la noche). Para evitar esto, carbón activado y / o un aditivo que degrada la molécula activa sin dañar las células bacterianas se pueden añadir a la muestra antes de la homogeneización. Otros métodos incluyen la centrifugación de las muestras para eliminar la mayoría del compuesto activo (que debe permanecer en el sobrenadante) y el empleo de diferente dilución y chapado esquemas para diluir suficientemente el compuesto activo a una concentración no inhibidora.
Como lo demuestran los ejemplos que se muestran en la Figura 2, este modelo de éxito induces infecciones pulmonares en los roedores con una amplia gama de organismos, incluidos los que no crecen bien en otros modelos (por ejemplo, H. influenzae). Estas infecciones son consistentes y reproducibles, lo que reduce la probabilidad de que tendrán que repetirse debido a la falta de modelo y / o de bajo rendimiento con un aislado concreto experimentos. Aunque los animales son inmunocompetentes, no son capaces de resolver rápidamente la infección, en todo caso. Esto permite una mayor flexibilidad en la longitud del estudio, como muchos aislados mantienen una infección viable a través de al menos 96 h sin la necesidad de inyecciones repetidas para mantener la neutropenia. El beneficio potencial de estudiar la eficacia antibacteriana en animales inmunocompetentes se ha señalado anteriormente 20, 21, y hay pruebas de que, para algunos compuestos (por ejemplo, oxazolidinonas), los datos de los roedores no neutropénicos pueden predecir con mayor precisión los objetivos de exposición humana en comparación con los neutropénicos prestados 5. La utilidad de usos múltiples de tque el modelo se demuestra en las figuras 3 y 4 y las Tablas 1 y 2. Estos estudios son parte de una gran colección de los datos publicados y no publicados que se ha generado con este modelo para apoyar los esfuerzos de optimización de plomo 16, 17, 22-24, para la comparación y la confirmación de la dosificación humana propuesto regímenes de 19, 25 a 29 y para la caracterización de PK / PD 18, 30-32 .While este modelo es inicialmente más complejo para llevar a cabo en comparación con el método intranasal inhalación, hay muchas ventajas como se describió anteriormente. Con la práctica y el uso rutinario, las técnicas deberían ser fáciles de realizar.
Se puede observar en algunos estudios que la carga bacteriana al inicio del estudio fue inferior a la que generalmente se busca en otros modelos de infección pulmonar. Esto se debe en gran parte a la dilución requerida en agar y el pequeño volumen desafío, particularmente en ratones. Sin embargo, también hay que señalarque el crecimiento de bacterias se observó en todos los casos, incluso cuando la carga inicial fue relativamente baja. La carga bacteriana de línea de base de destino es 6-6,5 log 10 CFU / pulmones (6,8 a 7,3 log 10 CFU / g de tejido en ratones en base a pesos de los pulmones promedio) que corresponde a densidades estimadas en pacientes humanos con neumonía grave 33. Una carga de línea de base más alta se puede lograr mediante la concentración aún más el inóculo bacteriano o retrasando el inicio de la administración del compuesto para permitir el crecimiento bacteriano adicional; Sin embargo, el aumento de la carga de interrogación en exceso puede conducir a la enfermedad anormalmente grave y aguda (es decir, la muerte en menos de 24 h) que es refractario a todos los tratamientos antibacterianos independientemente de la susceptibilidad. Aunque el inóculo se coloca inicialmente preferentemente en el pulmón izquierdo del animal, la infección generalmente se extiende a lo largo de ambos pulmones. La enfermedad progresiva pulmonar, la difusión de las bacterias a otros órganos, y la eventual morbilidad suele ser observed con S. pneumoniae, K. pneumoniae y P. aeruginosa. De interés, las infecciones por H. influenzae y A. baumannii son por lo general más contenida y rara vez conducen a la muerte en el inóculos bacterianos prescrito.
Los resultados de eficacia obtenidos a partir de este modelo se correlaciona bien con los perfiles de sensibilidad in vitro, así como objetivos PK / PD definidos. Las reducciones en la carga bacteriana se observan rutinariamente para aislamientos considerados susceptibles al agente que se está probando, mientras que las exposiciones resistente considerado ningún cambio o el crecimiento bacteriano de línea de base por encima de 16, 17, 19, 24-29. Los estudios en ratas que evalúan dos quinolonas y un macrólido usando este modelo 32 han demostrado que el objetivo PK / PD requerido para un 1-log 10 reducción de S. pneumoniae en comparación con la línea base correlacionado con el objetivo determinado en ratones neutropénicos y, más importante, con objetivos clínicos para pneum bacteriana adquirida en la comunidadOnia 6, 7, 34, 35. Gepotidacin, un novedoso mecanismo de antibióticos, se ensayó frente a S. pneumoniae y múltiple requiere un objetivo PK / PD similar para una reducción de 10 1-log en este modelo de infección pulmonar 31 como la requerida para una reducción de 10 1-log en el modelo del muslo neutropénico 36 cuando la penetración de pulmón fue tomada en cuenta (datos en archivo). Del mismo modo, los objetivos de PK / PD determinados en ratones para GSK2251052 contra P. aeruginosa fueron consistentes para la estasis, 1- y 2-log 10 reducciones de CFU entre este modelo de pulmón 30 y el modelo de infección del muslo neutropénico cuando la penetración de pulmón se consideró 37, 38 . Correlación con un modelo de infección pulmonar neutropenia mediante inoculación intranasal era pobre; sin embargo, GSK2251052 no produjo más de una respuesta estática en ese estudio 38. Esto puede ser atribuible a la inóculo bacteriano superior, que era 8 log 10 CFU / ratón, en comparación con 6 log <sub> 10 UFC / ratón en los neutropénicos muslo 37 y la intubación endotraqueal 30 modelos. Colección de datos como esto es fundamental para la evaluación comparativa, ya que permite la comparación directa con los modelos y correlación con los datos clínicos existentes para evaluar la capacidad de predicción de traslación. Un uso más generalizado de la intubación modelo de infección pulmonar intratraqueal proporcionará datos adicionales para este tipo de análisis.
Existen varias limitaciones de este modelo de neumonía inmunocompetentes. En primer lugar, no está bien adaptado a la evaluación de emergencia de la resistencia espontánea debido a la alta inóculo bacteriano requiere generalmente para este tipo de estudios resulta en una infección demasiado severa. Después de intentos para lograr cargas bacterianas de 7 u 8 log 10 UFC al inicio del estudio, la morbilidad rápida se ha observado (es decir, los animales se conviertan moribunda en menos de 24 h) a pesar de un lavado a fondo de los inóculos para eliminar toxinas pre-existente (datos en archivo). Esopuede ser posible superar este problema mediante el uso de los roedores más grandes. Las ratas, las ratas especialmente más pesados (> 250 g), parecen tolerar mejor superior inóculos en comparación con los ratones y pueden ser adecuados para este tipo de estudios. Una segunda limitación es que el uso de agar como una infección potenciador puede impedir usando el modelo para la evaluación de determinadas host: patógeno. Se cree que el agar proporciona un punto focal protegida hasta que la infección está plenamente establecida dentro del pulmón. Es posible administrar el inóculo en solución salina en lugar de agar para ayudar a superar este problema; sin embargo, debe tenerse en cuenta que esto sólo producirá la infección con algunas cepas. En tercer lugar, hay una curva de aprendizaje requerida para alcanzar la competencia en la técnica. El procedimiento puede ser delicado, especialmente en ratones. Es fácil de colocar por error la cánula de metal en el esófago, y la fuerza excesiva puede conducir a la punción ya sea del esófago o la tráquea. La colocación cuidadosa del inóculo es tambiénrequeridos o los animales pueden o no recuperarse o no estar infectados de manera adecuada. Sin embargo, con paciencia y perseverancia, se puede llegar a ser altamente competente y realizar la técnica con rapidez, suavidad y precisión.
Al eliminar el requisito de la neutropenia, lo que aumenta la robustez y reproducibilidad, lo que permite a los investigadores estudiar más patógenos y aislados, la mejora de la flexibilidad del diseño experimental y proporcionar una infección difícil de caracterizar la farmacodinamia de la neumonía, este modelo de infección pulmonar inmunocompetentes añade un valor sustancial para el descubrimiento de antibióticos comunidad. El mayor uso de este modelo por los investigadores adicionales ayudará a proporcionar la evaluación comparativa necesaria para que pueda obtener una mayor aceptación y continuar proporcionando información de apoyo para la interpretación apropiada.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JH desea reconocer y agradecer a mentor, amigo y ex gerente Valerie Berry para la primera que nos enseña este modelo; y Gary Woodnutt, que nos enseñó los fundamentos de la inspiración y nuestro compromiso con el campo de PK / PD antibacteriano. Todos los autores desean agradecer a David Payne por su apoyo y reconocimiento a nuestra ciencia. Nos gustaría reconocer a nuestro ex colegas es microbiología vivo que contribuyeron a la cantidad de datos generados usando estos métodos, especialmente Pete DeMarsh, Rob Straub, Roni página y Nerissa Simon. Por último, damos las gracias a nuestros colegas de microbiología in vitro por su ayuda, especialmente para proveer a todos los países de ingresos medios que solicitamos (Lynn McCloskey, Josh West y Sharon min); y para nuestro equipo de microbiología clínica que proporciona asesoramiento y apoyo (Linda Miller, Nicole Scangarella-Omán y Deborah Butler).
Materials
| TSA II Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood | Becton Dickinson and Company | 4321261 | |
| Chocolate II Agar | Becton Dickinson and Company | 4321267 | |
| BBL Brain Heart Infusion Broth Modified | Becton Dickinson and Company | 299070 | |
| BBL Trypticase Soy Broth with 20% Glycerol | Becton Dickinson and Company | 297808 | storage media for frozen stock |
| Inoculating loop | Nunc | 251586 | |
| 0.9% Sodium Chloride, USP | Baxter Healthcare Corporation | NDC 0338-0048-04 | |
| Difco Nutrient Agar | Becton Dickinson and Company | 213000 | |
| 30 ml free standing centrifuge tube with cap | EverGreen Scientific | 222-3530-G80 | |
| 50 ml Polypropylene Conical Tube 30 x115mm | Falcon, a Corning Brand | 352070 | |
| 14 ml Polypropylene Round-Bottom Tube 17 x 100mm | Falcon, a Corning Brand | 352059 | |
| Guide Tool | Intek Services Ltd | GT01 | custom-made metal cannula for rats |
| 90' Portex tubing | SAI | POR-080-100 | plastic cannula for rats |
| 1 ml TB syringe slip tip | Becton Dickinson and Company | 309659 | |
| PrecisionGlide Needle 25G x 5/8 | Becton Dickinson and Company | 305122 | |
| Animal feeding needle – straight 20×3" 2-1/4 | Popper and Sons, Inc | 7903 | used to create metal cannula for mice |
| Intramedic polyethylene tubing | Clay Adams brand – Becton Dickinson and Company | 427401 | plastic cannula for mouse |
| 75 TN 5.0ul syringe 26s/2"/2 | Hamilton | 87930 | HPLC glass injection syringe |
| Pyrex tube, culture 25×150 screwcap with rubber liner | Corning | 9825-25 | to autoclave/store metal cannulae |
| 70% isopropyl alcohol | Vi-Jon (Swan) | NDC 0869-0810-43 | |
| Isoflurane, USP | Piramal Healthcare | NDC 66794-013-10 | |
| Stomacher | Seward | Stomacher80 | |
| Stomacher 80 classic bags | Seward | BA6040 | |
| Assay plate, 96 well, round bottom | Costar, Corning Inc | 3795 | optional, for serial diluting |
| Blood Omni Plates | Hardy | #A127 | optional, rectangular blood plates |
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