Summary

Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear para a identificação de múltiplas fosfolarização de intrinsecamente desordenados Proteínas

Published: December 27, 2016
doi:

Summary

We describe here a method to identify multiple phosphorylations of an intrinsically disordered protein by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR), using Tau protein as a case study. Recombinant Tau is isotopically enriched and modified in vitro by a kinase prior to data acquisition and analysis.

Abstract

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer’s disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, abnormal phosphorylation of Tau. In the course of the molecular investigation of Tau functions and dysfunctions in the disease, nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy is used to identify the multiple phosphorylations of Tau. We present here detailed protocols of recombinant production of Tau in bacteria, with isotopic enrichment for NMR studies. Purification steps that take advantage of Tau’s heat stability and high isoelectric point are described. The protocol for in vitro phosphorylation of Tau by recombinant activated ERK2 allows for generating multiple phosphorylations. The protein sample is ready for data acquisition at the issue of these steps. The parameter setup to start recording on the spectrometer is considered next. Finally, the strategy to identify phosphorylation sites of modified Tau, based on NMR data, is explained. The benefit of this methodology compared to other techniques used to identify phosphorylation sites, such as immuno-detection or mass spectrometry (MS), is discussed.

Introduction

Um dos principais desafios da saúde no século 21 são as doenças neurodegenerativas, como a doença de Alzheimer (DA). Tau é uma proteína associada a microtúbulos que estimula a formação de microtúbulos (MT). Tau está igualmente envolvido em várias doenças neurodegenerativas, os chamados tauopatias, dos quais o mais conhecido é AD. Nestes distúrbios, Tau auto-agregados em filamentos helicoidais emparelhados (PHFs) e é encontrado modificado em muitos resíduos por modificações pós-translacionais (PTMS), tais como fosforilação 1. A fosforilação da proteína tau está implicado tanto na regulação da sua função fisiológica de estabilização de MT e da perda da função patológica que caracteriza neurónios AD.

Além disso, a proteína Tau, quando integrado no PHF em neurónios doentes, é invariavelmente hiperfosforilada 2. Ao contrário Tau normal que contém 2-3 grupos fosfato, o Tau hiperfosforilada em PHF contém 5-9 phosphate os grupos 3. Hiperfosforilação de Tau corresponde tanto a um aumento da estequiometria em alguns locais e a fosforilação de sítios adicionais que são chamados locais de fosforilação patológicas. No entanto, existe sobreposição entre AD e padrões adultos normais de fosforilação, apesar das diferenças quantitativas no nível 4. Como eventos de fosforilação função de influência e disfunção de Tau específica permanece em grande parte desconhecido. Nosso objetivo é decifrar regulação Tau por PTMs no nível molecular.

Para aprofundar a compreensão dos aspectos moleculares de Tau, temos de enfrentar os desafios técnicos. Em primeiro lugar, uma proteína tau é intrinsecamente desordenados (PDI), quando isolados em solução. Estas proteínas não têm estrutura tridimensional bem definida em condições fisiológicas e requerem determinados métodos biofísicos para estudar a sua função (s) e as propriedades estruturais. Tau é um paradigma para a crescente classe dos deslocados internos, muitas vezes encontrados associadospatologias como doenças neurodegenerativas, aumentando assim o interesse para compreender os parâmetros moleculares subjacentes suas funções. Em segundo lugar, a caracterização de Tau fosforilação é um desafio analítico, com 80 potenciais locais de fosforilação ao longo da sequência da tau isoforma mais longa 441 amino-ácido. Um certo número de anticorpos têm sido desenvolvidos contra epítopos de tau fosforilados e são utilizados para a detecção de tau patológica em neurónios ou tecido cerebral. eventos de fosforilação pode ter lugar em, pelo menos 20 locais visados ​​pelas cinases dirigidas-prolina, a maioria deles em estreita proximidade no interior da região rica em prolina. O qualitativa (que sites?) E caracterização quantitativa (o que estequiometria?) É difícil, mesmo pelas mais recentes técnicas de MS 5.

espectroscopia de RMN pode ser utilizada para investigar as proteínas desordenados que são altamente dinâmicos sistemas constituídos por conjuntos de confórmeros. espectroscopia de RMN de alta resolução foi apliEd para investigar a estrutura e função da proteína tau. Além disso, a complexidade do perfil a fosforilação da tau, levou ao desenvolvimento de ferramentas moleculares e novos métodos de análise utilizando RMN para a identificação de sítios de fosforilação 6 8. RMN como um método analítico permite a identificação de locais de fosforilação da tau de um modo global, a visualização de todas as modificações de sítio único numa única experiência, e a quantificação da extensão da incorporação de fosfato. Este ponto é essencial, pois embora os estudos de fosforilação sobre Tau abundam na literatura, a maioria deles têm sido realizados com anticorpos, deixando um grande grau de incerteza sobre o perfil completo de fosforilação e, assim, o verdadeiro impacto de eventos de fosforilação individuais. cinases recombinantes incluindo PKA, 3β glicogênio sintase-quinase (Gsk3β), ciclina dependente de quinase 2 / ciclina A (CDK2 / CycA), quinase ciclina-dependentes 5 (CDK5) / p25 actproteína ivator,-extracelular sinal-quinase regulada 2 (ERK2) e microtúbulos-quinase regula-afinidade (MARK), que apresentam uma actividade no sentido de fosforilação da tau, pode ser preparada numa forma activa. Além disso, os mutantes Tau que permitem a geração de isoformas da proteína tau específicas com padrões de fosforilação bem caracterizados são usadas para decifrar o código de fosforilação de tau. Espectroscopia de RMN é então usado para caracterizar amostras Tau enzimaticamente modificados 6 8. Embora a fosforilação in vitro de tau é mais difícil do que o pseudo-fosforilação tal como por mutação da seleccionados Ser / Thr em resíduos de ácido glutâmico (Glu), esta abordagem tem as suas vantagens. De facto, nem os parâmetros de impacto nem interacção estruturais de fosforilação pode sempre ser mimetizado por ácidos glutâmicos. Um exemplo é o motivo por sua vez observada em torno fosfoserina 202 (pSer202) / fosfotreonina 205 (pThr205), que não é reproduzida com Glu mutações 9.

<p class = "jove_content"> Aqui, a preparação de Tau marcado isotopicamente para investigações de RMN serão descritos em primeiro lugar. proteína tau fosforilada por ERK2 é modificado em vários sites descritos como locais patológicos de fosforilação, e, portanto, representa um interessante modelo de Tau hiperfosforilada. Um protocolo detalhado de Tau na fosforilação in vitro pela quinase ERK-2 recombinante é apresentada. ERK2 é activada por fosforilação de proteína quinase activada mitogénio / ERK-cinase (MEK) 10-12. Além disso para a preparação de proteína Tau modificado, marcado isotopicamente, a estratégia de RMN utilizado para a identificação do PTMs é descrito.

Protocol

1. Produção de 15 N, 13 C-tau (Figura 1) Transformar pET15b-tau recombinante de T7 expressão plasmídeo 13,14 em BL21 (DE3) competente de Escherichia coli, células bacterianas 15. NOTA: o ADNc que codifica para o mais longo (441 resíduos de aminoácidos) isoforma da tau é clonado entre os locais de restrição Ncol e Xhol no plasmídeo pET15b. Misturar suavemente 50 ul de células (DE3), formando 1-5 x 10 7…

Representative Results

A Figura 3A mostra um pico principal de absorção a 280 nm observados durante o gradiente de eluio. Este pico corresponde à proteína Tau purificada como visto no gel de acrilamida sobre o cromatograma. A Figura 3B mostra um pico de absorção bem separadas a 280 nm e o pico de condutividade, assegurando que a dessalinização da proteína é eficiente. A Figura 4 mostra a proteína de desvio em gel observada por análise de SDS-PAGE a 16 característica de fosforilação de pr…

Discussion

Temos usado espectroscopia de RMN para caracterizar amostras Tau enzimaticamente modificados. A expressão recombinante e purificação descritos aqui para a proteína tau humana de comprimento completo podem ser igualmente utilizados para produzir domínios tau ou mutantes Tau. Isotopicamente enriquecido proteína é necessária para a espectroscopia de RMN, necessitando de expressão recombinante. Identificação dos locais de fosforilação exige atribuição de ressonância e uma proteína duplamente marcada de…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The NMR facilities were funded by the Région Nord, CNRS, Pasteur Institute of Lille, European Community (FEDER), French Research Ministry and the University of Sciences and Technologies of Lille. We acknowledge support from the TGE RMN THC (FR-3050, France), FRABio (FR 3688, France) and Lille NMR and RPE Health and Biology core facility. Our research is supported by grants from the LabEx (Laboratory of Excellence) DISTALZ (Development of Innovative Strategies for a Transdisciplinary approach to Alzheimer’s disease), EU ITN TASPPI and ANR BinAlz.

Materials

pET15B recombinant T7 expression plasmid Novagen 69257 Keep at -20°C
BL21(DE3) transformation competent E.coli bacteria New England Biolabs C2527I Keep at -80°C
Autoclaved LB Broth, Lennox  DIFCO 240210 Bacterial Growth Medium
MEM vitamin complements 100X Sigma 58970C Bacterial Growth Medium Supplement
15N, 13C-ISOGRO complete medium powder Sigma 608297 Bacterial Growth Medium Supplement
15NH4Cl Sigma 299251 Isotope
13C6-Glucose Sigma 389374 Isotope
Protease inhibitor tablets  Roche 5056489001 Keep at 4°C
1 tablet in 1ml is 40X solution that can be kept at -20°C
DNaseI EUROMEDEX 1307 Keep at -20°C
Homogenizer (EmulsiFlex-C3) AVESTIN Lysis is realized at 4°C
Pierce™ Unstained Protein MW Marker Pierce 266109
Active human MEK1 kinase, GST Tagged Sigma M8822 Keep at -80°C
AKTÄ Pure chromatography system GE Healthcare FPLC
HiTrap SP Sepharose FF (5 mL column) GE Healthcare 17-5156-01 Cation exchange chromatography columns
HiPrep 26/10 Desalting GE Healthcare 17-5087-01 Protein Desalting column
PD MidiTrap G-25 GE Healthcare 28-9180-08 Protein Desalting column
Tris D11, 97% D Cortecnet CD4035P5 Deuterated NMR buffer
5 mm Symmetrical Microtube SHIGEMI D2O ( set of 5 inner & outerpipe)  Euriso-top BMS-005B NMR Shigemi Tubes
eVol kit-electronic syringe starter kit Cortecnet 2910000 Pipetting
Bruker 900MHz AvanceIII with a triple resonance cryogenic probehead Bruker NMR spectrometer for data acquisition
Bruker 600MHz DMX600 with a triple resonance cryogenic probehead Bruker NMR spectrometer for data acquisition
TopSpin 3.1 Bruker Acquisition and Processing software for NMR experiments
Sparky 3.114 UCSF (T. D. Goddard and D. G. Kneller) NMR data Analysis software

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Danis, C., Despres, C., Bessa, L. M., Malki, I., Merzougui, H., Huvent, I., Qi, H., Lippens, G., Cantrelle, F., Schneider, R., Hanoulle, X., Smet-Nocca, C., Landrieu, I. Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered Proteins. J. Vis. Exp. (118), e55001, doi:10.3791/55001 (2016).

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