Summary

In vivo onderzoek naar Antimicrobial Blue Light therapie voor Multiresistente Acinetobacter baumannii Burn Infecties met behulp van bioluminescentie Imaging

Published: April 28, 2017
doi:

Summary

Infections caused by multidrug-resistant (MDR) bacterial strains have emerged as a serious threat to public health, necessitating the development of alternative therapeutics. We present a protocol to evaluate the effectiveness of antimicrobial blue light (aBL) therapy for MDR Acinetobacter baumannii infections in mouse burns by using bioluminescence imaging.

Abstract

Burn-infecties blijft een belangrijke oorzaak van morbiditeit en mortaliteit. De toenemende opkomst van multiresistente (MDR) bacteriën heeft geleid tot het veelvuldig falen van de traditionele behandelingen met antibiotica. Alternatieve therapieën zijn dringend nodig om MDR bacteriën aan te pakken.

Een innovatieve non-antibioticum aanpak heeft antimicrobiële blauw licht (ABL), veelbelovende werkzaamheid tegen MDR infecties getoond. Het werkingsmechanisme van Abl is nog niet goed begrepen. Algemeen wordt verondersteld dat natuurlijk voorkomende endogene chromoforen fotosensibiliserende in bacteriën (bijvoorbeeld ijzer-vrije porfyrinen, flavinen, etc.) worden geëxciteerd door ABL, dat op zijn beurt cytotoxische reactieve zuurstof species (ROS) door middel van een fotochemisch proces.

In tegenstelling tot andere op basis van licht antimicrobiële aanpak, antimicrobiële fotodynamische therapie (APDT), ABL therapie niet de betrokkenheid van een exogene photosensitiz vereisener. Alles wat het nodig door te voeren is het bestralen van blauw licht; daarom is eenvoudig en goedkoop. ABL receptoren zijn de endogene cellulaire fotosensibilisatoren in bacteriën, in plaats van het DNA. Aldus Abl wordt aangenomen minder genotoxisch cellen dan ultraviolet C (UVC) straling, die direct veroorzaakt DNA-schade in gastheercellen hosten.

In deze paper presenteren we een protocol om de effectiviteit van ABL therapie voor MDR Acinetobacter baumannii infecties in een muismodel van brandwonden te beoordelen. Door het gebruik van een aangelegde lichtgevende stam, waren we in staat om niet-invasieve toezicht op de omvang van de besmetting in real time in levende dieren. Deze techniek is ook een effectief instrument om de ruimtelijke verdeling van infecties bij dieren.

Introduction

Burn-infecties, die vaak worden gerapporteerd als gevolg van cutane thermische verwondingen, nog steeds een belangrijke oorzaak van morbiditeit en mortaliteit 1 zijn. Het beheer van branden infecties is verder aangetast door de toenemende opkomst van multidrug-resistente (MDR) bacteriestammen 2 als gevolg van het massale gebruik van antibiotica. Een belangrijke MDR Gram-negatieve bacteriën is Acinetobacter baumannii, waarvan bekend is dat in verband worden gebracht met de recente strijd wonden en is bestand tegen bijna alle beschikbare antibiotica 3. De aanwezigheid van biofilms bij gewonde brandpunten gerapporteerd 4, 5 en wordt verondersteld om de tolerantie voor antibiotica en afweer 6, 7 verergeren, waardoor persistente infecties 8, 9. Daarom is er een pressing nodig hebben voor de ontwikkeling van alternatieve behandelingen. In de onlangs aangekondigde nationale strategie ter bestrijding van antibiotica-resistente bacteriën, heeft de ontwikkeling van alternatieve therapieën voor de antibiotica is genoteerd als een actie van de regering van de Verenigde Staten 10.

Light-based antimicrobiële benaderingen, zoals aangegeven door de naam, licht nodig bestraling met of zonder andere middelen. Deze benaderingen omvatten antimicrobiële fotodynamische therapie (APDT), ultraviolet-C (UVC) straling en antimicrobiële blauw licht (ABL). In eerdere studies, hebben zij veelbelovende effectiviteit getoond in het doden van MDR bacteriestammen 11, 12, 13. Van de drie licht-gebaseerde benaderingen, heeft ABL trok steeds meer aandacht in de afgelopen jaren als gevolg van de intrinsieke antibacteriële eigenschappen zonder het gebruik van fotosensitizers 14. in Comparison APDT tot, Abl betreft slechts het gebruik van licht, terwijl APDT een combinatie van licht en een fotosensibilisator vereist. Daarom abl eenvoudig en goedkoop 14. In vergelijking met UVC wordt ABL vermoedelijk veel minder cytotoxische en genotoxische aan cellen 15 hosten.

Het doel van dit protocol is om de effectiviteit van ABL voor de behandeling van brandwonden infecties veroorzaakt door MDR A. baumannii in een muismodel onderzoeken. We maken gebruik van bioluminescente pathogene bacteriën om nieuwe muismodellen van burn infecties die de niet-invasieve monitoring van de bacteriële last in real time mogelijk te ontwikkelen. Vergeleken met de traditionele methode lichaamsvloeistof / weefsel bemonstering gevolgd door platen en kolonies tellen 16, verschaft deze techniek nauwkeurige resultaten. Werkwijze weefselmonsters kunnen andere bron van experimentele fouten introduceren. Aangezien de bacteriële luminescentie-intensiteit is lineair evenredig met de Correskomstige bacteriële CFU 17, kunnen we direct de overleving van bacteriën te meten na een bepaalde dosis van lichtbestraling. Door het bewaken van het aantal bacteriën in levende dieren die het lichtbehandeling in real time, kan de kinetiek van bacteriële doding worden gekarakteriseerd met een aanzienlijk verminderd aantal muizen.

Protocol

1. Bereiding bacteriekweek Voeg 7,5 ml Brain Heart Infusion (BHI) medium in een 50 ml centrifugebuis. Zaad A. baumannii cellen in BHI medium en incubeer de A. baumannii cultuur in een orbitale incubator (37 ° C) gedurende 18 uur. Centrifugeer de kweek van cellen bij 3500 xg gedurende 5 minuten, verwijder het supernatant en was de pellets in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Resuspendeer de bacteriën pellets in vers PBS en grondig pipet de schorsing. Verza…

Representative Results

A. baumannii stam die we gebruikten een MDR klinische isolaat, zoals eerder 12, 17 gemeld. De bacteriële stam werd bioluminescente gemaakt door transfectie van luxCDABE opera 11. Figuur 1A toont de opeenvolgende bacterieel luminescentie beelden van een representatieve muis branden geïnfecteerd met 5 x 10 6 A. baumannii en blootgesteld aan één bloot…

Discussion

abl is een nieuwe werkwijze voor het behandelen van infecties. Omdat het werkingsmechanisme is volledig verschillend van die van de chemotherapie, het is meer een fysiotherapie. Het middel dat het antimicrobiële effect medieert is bestraling met blauw licht (400-470 nm). Met de ontwikkeling van blauwe LED's, kregen we toegang tot een effectieve en eenvoudige licht gebaseerde antimicrobiële aanpak voor MDR infecties.

In dit protocol hebben we beschreven de ontwikkeling van een muismodel…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported in part by the Center for Integration of Medicine and Innovative Technology (CIMIT) under the U.S. Army Medical Research Acquisition Activity Cooperative Agreement (CIMIT No. 14-1894 to TD) and the National Institutes of Health (1R21AI109172 to TD). YW was supported by an ASLMS Student Research Grant (BS.S02.15). We are grateful to Tayyaba Hasan, PhD at the Wellman Center for her co-mentorship for YW.

Materials

IVIS  PerkinElmer Inc, Waltham, MA IVIS Lumina Series III Pre-clinical in vivo imaging
Light-emitting diode LED VieLight Inc, Toronto, Canada  415 nm Light source for illumination
Power/energy meter Thorlabs, Inc., Newton, NJ PM100D Light irradiance detector
Mouse  Charles River Laboratories, Wilmington, MA BALB/c 7-8 weeks age, 17-19 g weight
Acinetobacter baumannii  Brooke Army Medical Center, Fort Sam Houston, TX Clinical isolate Engineered luminescent strain
Insulin Syringes Fisher Scientific 14-826-79 BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes for injection
Sodium Chloride Fisher Scientific 721016 0.9% Sodium Chloride
Phosphate Buffered Saline, 1X Solution Fisher Scientific BP24384  A standard phosphate buffer used in many biomolecular procedures
Brain Heart Infusion Fisher Scientific B11059 Bacterial culture medium
Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-959-70C For bacterial suspension centrifuge
Benchtop Incubated Orbital Shakers Laboratory Supply Network, Inc, Atkinson, NH  Incu-Shaker Mini For culturing of bacteria
Inoculating Loops Fisher Scientific 22-363-605   For smearing bacterial inoclum on burn surface of mice
Fisher Scientific Redi-Tip Pipet Tips, 1-200µL Fisher Scientific 02-707-502 Pipet Tips
Thermo Scientific Sorvall Legend X1 Centrifuge Fisher Scientific 75-004-220 For bacterial suspension seperation
Brass Block Small Parts, Inc., Miami, FL 10 mm by 10 mm  For creation of burns in mice
Extreme Dragon PBI/Kevlar High-Heat Gloves Superior Glove Works Ltd, Cheektowaga, NY PBI83514  Heat Resistant Gloves
Greiner dishes Sigma-Aldrich Co. LLC P5112-740EA 35 mm ×10 mm
Corning Digital Hot Plate Cole-Parmer Instrument Company, LLC UX-84301-65 10" x 10", 220 VAC, for boiling water 
Mouse/Rat Thin Line Water Heated Surgical Bed E-Z Systems EZ-211 Prevents heat loss and hypothermia during surgery

Referencias

  1. Gibran, N. S. Summary of the 2012 ABA Burn Quality Consensus conference. J Burn Care Res. 34 (4), 361-385 (2013).
  2. Sommer, R., Joachim, I., Wagner, S., Titz, A. New approaches to control infections: anti-biofilm strategies against gram-negative bacteria. Chimia (Aarau). 67 (4), 286-290 (2013).
  3. Peleg, A. Y., Seifert, H., Paterson, D. L. Acinetobacter baumannii: emergence of a successful pathogen. Clin Microbiol Rev. 21 (3), 538-582 (2008).
  4. Uppu, D. S. Amide side chain amphiphilic polymers disrupt surface established bacterial bio-films and protect mice from chronic Acinetobacter baumannii infection. Biomaterials. 74, 131-143 (2016).
  5. Schaber, J. A. Pseudomonas aeruginosa forms biofilms in acute infection independent of cell-to-cell signaling. Infect Immun. 75 (8), 3715-3721 (2007).
  6. Hoiby, N., Bjarnsholt, T., Givskov, M., Molin, S., Ciofu, O. Antibiotic resistance of bacterial biofilms. Int J Antimicrob Agents. 35 (4), 322-332 (2010).
  7. Lebeaux, D., Ghigo, J. M., Beloin, C. Biofilm-related infections: bridging the gap between clinical management and fundamental aspects of recalcitrance toward antibiotics. Microbiol Mol Biol Rev. 78 (3), 510-543 (2014).
  8. Akers, K. S. Biofilms and persistent wound infections in United States military trauma patients: a case-control analysis. BMC Infect Dis. 14, 190 (2014).
  9. Burmolle, M., et al. Biofilms in chronic infections – a matter of opportunity – monospecies biofilms in multispecies infections. FEMS Immunol Med Microbiol. 59 (3), 324-336 (2010).
  10. . National strategy on combating antibiotic-resistant bacteria Available from: https://www.whitehouse.gov/sites/default/files/docs/carb_national_strategy.pdf (2014)
  11. Dai, T. Photodynamic therapy for Acinetobacter baumannii burn infections in mice. Antimicrob Agents Chemother. 53 (9), 3929-3934 (2009).
  12. Zhang, Y. Antimicrobial blue light therapy for multidrug-resistant Acinetobacter baumannii infection in a mouse burn model: implications for prophylaxis and treatment of combat-related wound infections. J Infect Dis. 209 (12), 1963-1971 (2014).
  13. Dai, T., et al. Ultraviolet C light for Acinetobacter baumannii wound infections in mice: potential use for battlefield wound decontamination?. J Trauma Acute Care Surg. 73 (3), 661-667 (2012).
  14. Dai, T. Blue light for infectious diseases: Propionibacterium acnes, Helicobacter pylori, and beyond?. Drug Resist Updat. 15 (4), 223-236 (2012).
  15. Yin, R. Light based anti-infectives: ultraviolet C irradiation, photodynamic therapy, blue light, and beyond. Curr Opin Pharmacol. 13 (5), 731-762 (2013).
  16. Haisma, E. M. Inflammatory and antimicrobial responses to methicillin-resistant Staphylococcus aureus in an in vitro wound infection model. PLoS One. 8 (12), e82800 (2013).
  17. Wang, Y. Antimicrobial Blue Light Inactivation of Gram-Negative Pathogens in Biofilms: In Vitro and In Vivo Studies. J Infect Dis. 213 (9), 1380-1387 (2016).
  18. Chen, D., Shen, Y., Huang, Z., Li, B., Xie, S. Light-Emitting Diode-Based Illumination System for In Vitro Photodynamic Therapy. Int J Photoenergy. 2012 (2), (2012).
  19. Demidova, T. N., Gad, F., Zahra, T., Francis, K. P., Hamblin, M. R. Monitoring photodynamic therapy of localized infections by bioluminescence imaging of genetically engineered bacteria. J Photochem Photobiol B. 81 (1), 15-25 (2005).
  20. Hamblin, M. R., Zahra, T., Contag, C. H., McManus, A. T., Hasan, T. Optical monitoring and treatment of potentially lethal wound infections in vivo. J Infect Dis. 187 (11), 1717-1725 (2003).
  21. Rowan, M. P. Burn wound healing and treatment: review and advancements. Critical Care. 19, 243 (2015).
  22. Marx, D. E., Barillo, D. J. Silver in medicine: The basic science. Burns. 40 (Supplement 1), S9-S18 (2014).
  23. Heyneman, A., Hoeksema, H., Vandekerckhove, D., Pirayesh, A., Monstrey, S. The role of silver sulphadiazine in the conservative treatment of partial thickness burn wounds: A systematic review. Burns. 42 (7), 1377-1386 (2016).
  24. Roberts, J. A. Individualised antibiotic dosing for patients who are critically ill: challenges and potential solutions. Lancet Infect Dis. 14 (6), 498-509 (2014).
  25. Dai, T. Blue light eliminates community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus in infected mouse skin abrasions. Photomed Laser Surg. 31 (11), 531-538 (2013).
  26. Uppu, D. S. Amide side chain amphiphilic polymers disrupt surface established bacterial bio-films and protect mice from chronic Acinetobacter baumannii infection. Biomaterials. 74, 131-143 (2016).
  27. Donlan, R. M., Costerton, J. W. Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms. Clin Microbiol Rev. 15 (2), 167-193 (2002).
  28. Olsen, I. Biofilm-specific antibiotic tolerance and resistance. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. , (2015).
  29. Song, H. H. Phototoxic effect of blue light on the planktonic and biofilm state of anaerobic periodontal pathogens. J Periodontal Implant Sci. 43 (2), 72-78 (2013).
  30. Rosa, L. P., da Silva, F. C., Viana, M. S., Meira, G. A. In vitro effectiveness of 455-nm blue LED to reduce the load of Staphylococcus aureus and Candida albicans biofilms in compact bone tissue. Lasers Med Sci. 31 (1), 27-32 (2015).
  31. Guffey, J. S., Wilborn, J. In vitro bactericidal effects of 405-nm and 470-nm blue light. Photomed Laser Surg. 24 (6), 684-688 (2006).
  32. Enwemeka, C. S., Williams, D., Enwemeka, S. K., Hollosi, S., Yens, D. Blue 470-nm light kills methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in vitro. Photomed Laser Surg. 27 (2), 221-226 (2009).
  33. Bumah, V. V., Masson-Meyers, D. S., Cashin, S. E., Enwemeka, C. S. Wavelength and bacterial density influence the bactericidal effect of blue light on methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA). Photomed Laser Surg. 31 (11), 547-553 (2013).
  34. Maclean, M., MacGregor, S. J., Anderson, J. G., Woolsey, G. Inactivation of bacterial pathogens following exposure to light from a 405-nanometer light-emitting diode array. Appl Environ Microbiol. 75 (7), 1932-1937 (2009).
  35. Kim, M. Optical lens-microneedle array for percutaneous light delivery. Biomedical Optics Express. 7 (1o), 4220-4227 (2016).

Play Video

Citar este artículo
Wang, Y., Harrington, O. D., Wang, Y., Murray, C. K., Hamblin, M. R., Dai, T. In Vivo Investigation of Antimicrobial Blue Light Therapy for Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii Burn Infections Using Bioluminescence Imaging. J. Vis. Exp. (122), e54997, doi:10.3791/54997 (2017).

View Video