שילוב רטוב טכניקות מעבדה יבשות כדי להנחות את ההתגבשות של חלבונים מפותל, סליל גדולים המכיל
Summary
We describe a framework incorporating straightforward biochemical and computational analysis to guide the characterization and crystallization of large coiled-coil domains. This framework can be adapted for globular proteins or extended to incorporate a variety of high-throughput techniques.
Abstract
Obtaining crystals for structure determination can be a difficult and time consuming proposition for any protein. Coiled-coil proteins and domains are found throughout nature, however, because of their physical properties and tendency to aggregate, they are traditionally viewed as being especially difficult to crystallize. Here, we utilize a variety of quick and simple techniques designed to identify a series of possible domain boundaries for a given coiled-coil protein, and then quickly characterize the behavior of these proteins in solution. With the addition of a strongly fluorescent tag (mRuby2), protein characterization is simple and straightforward. The target protein can be readily visualized under normal lighting and can be quantified with the use of an appropriate imager. The goal is to quickly identify candidates that can be removed from the crystallization pipeline because they are unlikely to succeed, affording more time for the best candidates and fewer funds expended on proteins that do not produce crystals. This process can be iterated to incorporate information gained from initial screening efforts, can be adapted for high-throughput expression and purification procedures, and is augmented by robotic screening for crystallization.
Introduction
קביעת מבנה באמצעות קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן תרם תרומות היסוד לכל תחום הביולוגיה המודרנית; מתן נוף אטומי של מקרומולקולות תומכי חיים וכיצד הם פועלים אחד עם השני במגוון קשרים; מה שמאפשר לנו להבין את המנגנונים שגורמים הזדמנויות מחלה ומתן לתכנן תרופות לטיפול במחלות באופן רציונלי. קריסטלוגרפיה כבר זמן רב בטכניקה הניסויית הדומיננטית לקביעת מבנה macromolecular, וכיום מהווה 89.3% של מסד הנתונים המבניים (www.rcsb.org). טכניקה זו יש יתרונות רבים, לרבות הסכנה האפשרית ברזולוציה גבוהה מאוד, את היכולת לדמיין מקרומולקולות עם מגוון רחב של גדלים, איסוף נתונים קל יחסית, ואת ההזדמנות כדי להמחיש כיצד מקרומולקולה אינטראקציה עם ממס וכן הליגנדים.
למרות שיפורים טכנולוגיים רבים בביטוי חלבון רקומביננטי 1,2, PURification 3, וביולוגיה מולקולרית המשמשת לייצור מערכות אלה 4, המכשול הגדול ביותר בתהליך crystallographic נשאר היכולת לצמוח גבישים באיכות עקיפה. זה היה נכון במיוחד עבור חלבונים אשר מכילים תחומים מפותל-סליל גדול. הערכה הוא כי ככל 5% מכלל חומצות אמינו נמצאים בתוך מפותל, סליליים 5,6, כך שתכונה זו יישאר 7 מבנית מאוד נפוצה, עדיין חלבונים אלה הם בדרך כלל יותר קשים לטהר להתגבש מאשר חלבונים כדוריים 8-10 . זה מורכב עוד יותר בשל העובדה כי תחומים סליל מפותל נמצאים לעתים קרובות בהקשר של חלבון גדול יותר, ולכן כראוי מנבאים את גבולות תחומים אלה היא קריטית כדי למנוע הכללת רצף מובנה או גמיש כי הוא לעתים קרובות מזיק לתהליך גיבושו.
כאן אנו מציגים מסגרת מושגית שילוב חישובית מבוסס אינטרנט מנתח עם experimentaנתוני l מהספסל, כדי לסייע למשתמשי מדריך דרך בשלבים הראשונים של תהליך crystallographic כוללים: כיצד לבחור מקטעי חלבון (ים) ללימודים מבניים, וכיצד להכין ולאפיין דגימות חלבון לפני ניסיונות התגבשות. המחקר הנוכחי על שני חלבונים המכילים תחומים מפותל-סליל גדול, Shroom (SHRM) ו Rho-kinase (רוק). חלבונים אלה נבחרו שניהם מכילים תחומי סליל מפותל וידועים לגבש 11-16 מורכבים רלוונטיים מבחינה ביולוגית. Shroom ו Rho-kinase (רוק) הם חזו מכילים ~ 200 ו 680 שאריות של סליל מפותל בהתאמה, רבי חלקים אשר מתאפיינים מבני 17-20. השיטה המתוארת כאן מספקת זרימת עבודה יעילה לזהות שברים במהירות של חלבון המכיל סליל מפותל כי יהיו מוכנים לשתף פעולה עבור התגבשות, אולם, הטכניקות המתוארות ניתן להתאים בקלות עבור רוב החלבון או חלבון מתחמים או שונות לשלב approa תפוקה גבוההצ 'ס כזמין. לבסוף, שיטות אלה הן זולות בדרך כלל יכולות להתבצע על ידי משתמש כמעט בכל רמות הניסיון.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול המתואר כאן נועד לעזור למשתמש לזהות גבולות התחום בתוך חלבונים מפותל-סליל גדול כדי להקל התגבשות שלהם. הפרוטוקול מסתמך על שילוב הוליסטי של מגוון נתונים מתחזיות חישובית ומקורות אחרים כדי ליצור סדרה של גבולות תחום פוטנציאליים. אלה ואחריו סט של ניסויים ביוכימי?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grant NIH R01 GM097204 (APV and JDH). Funding for JHM was supplied by an HHMI Undergraduate Research Summer Fellowship.
Materials
| BL21(DE3) Rosetta | Emd Millipore | 70954-3 | |
| BL21(DE3) Star | ThermoFisher Scientific | C601003 | |
| BL21(DE3) Codon Plus | Agilent Technologies | 230245 | |
| Lysozyme | Spectrum Chemical Mfg Corp | L3008-5GM | |
| Ni-NTA resin | Life Technologies | 25216 | |
| SubtilisinA | Spectrum Chemical Mfg Corp | S1211-10ML | |
| 24 well Cryschem Plate | Hampton research | HR3-160 | |
| INTELLI-PLATE 96: | Art Robbins Instruments | 102-0001-03 | |
| PEG 3350 | Hampton research | HR2-591 | |
| PEG 8000 | Hampton research | HR2-515 | |
| PEG 400 | Hampton research | HR2-603 | |
| PEG 4000 | Hampton research | HR2-605 | |
| pcDNA3.1-Clover-mRuby2 | Addgene | 49089 | |
| Overnight Express Autoinduction System 1 | Emd Millipore | 71300 | |
| Lysogeny Broth powder | ThermoFisher Scientific | 12795027 |
Referencias
- Studier, F. W. Stable expression clones and auto-induction for protein production in E. coli. Methods Mol Biol. 1091, 17-32 (2014).
- Studier, F. W., Moffatt, B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. J Mol Biol. 189 (1), 113-130 (1986).
- Chapman, T. Protein purification: pure but not simple. Nature. 434 (7034), 795-798 (2005).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Lupas, A., Van Dyke, M., Stock, J. Predicting coiled coils from protein sequences. Science. 252 (5009), 1162-1164 (1991).
- Offer, G., Hicks, M. R., Woolfson, D. N. Generalized Crick equations for modeling noncanonical coiled coils. J Struct Biol. 137 (1-2), 41-53 (2002).
- Lupas, A. N., Gruber, M. The structure of alpha-helical coiled coils. Adv Protein Chem. 70, 37-78 (2005).
- Hernandez Alvarez, B., et al. A new expression system for protein crystallization using trimeric coiled-coil adaptors. Protein Eng Des Sel. 21 (1), 11-18 (2008).
- Slabinski, L., et al. The challenge of protein structure determination–lessons from structural genomics. Protein Sci. 16 (11), 2472-2482 (2007).
- Slabinski, L., et al. XtalPred: a web server for prediction of protein crystallizability. Bioinformatics. 23 (24), 3403-3405 (2007).
- Haigo, S. L., Hildebrand, J. D., Harland, R. M., Wallingford, J. B. Shroom induces apical constriction and is required for hingepoint formation during neural tube closure. Curr Biol. 13 (24), 2125-2137 (2003).
- Hildebrand, J. D. Shroom regulates epithelial cell shape via the apical positioning of an actomyosin network. J Cell Sci. 118 (Pt 22), 5191-5203 (2005).
- Dietz, M. L., Bernaciak, T. M., Vendetti, F., Kielec, J. M., Hildebrand, J. D. Differential actin-dependent localization modulates the evolutionarily conserved activity of Shroom family proteins. J Biol Chem. 281 (29), 20542-20554 (2006).
- Bolinger, C., Zasadil, L., Rizaldy, R., Hildebrand, J. D. Specific isoforms of drosophila shroom define spatial requirements for the induction of apical constriction. Dev Dyn. 239 (7), 2078-2093 (2010).
- Farber, M. J., Rizaldy, R., Hildebrand, J. D. Shroom2 regulates contractility to control endothelial morphogenesis. Mol Biol Cell. 22 (6), 795-805 (2011).
- Das, D., et al. The interaction between Shroom3 and Rho-kinase is required for neural tube morphogenesis in mice. Biol Open. 3 (9), 850-860 (2014).
- Dvorsky, R., Blumenstein, L., Vetter, I. R., Ahmadian, M. R. Structural insights into the interaction of ROCKI with the switch regions of RhoA. J Biol Chem. 279 (8), 7098-7104 (2004).
- Mohan, S., et al. Structure of a highly conserved domain of Rock1 required for Shroom-mediated regulation of cell morphology. PLoS One. 8 (12), e81075 (2013).
- Mohan, S., et al. Structure of Shroom domain 2 reveals a three-segmented coiled-coil required for dimerization, Rock binding, and apical constriction. Mol Biol Cell. 23 (11), 2131-2142 (2012).
- Tu, D., et al. Crystal structure of a coiled-coil domain from human ROCK I. PLoS One. 6 (3), e18080 (2011).
- Sievers, F., et al. Fast, scalable generation of high-quality protein multiple sequence alignments using Clustal Omega. Mol Syst Biol. 7, 539 (2011).
- Shapiro, A. L., Vinuela, E., Maizel, J. V. Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels. Biochem Biophys Res Commun. 28 (5), 815-820 (1967).
- Diezel, W., Kopperschlager, G., Hofmann, E. An improved procedure for protein staining in polyacrylamide gels with a new type of Coomassie Brilliant Blue. Anal Biochem. 48 (2), 617-620 (1972).
- Wittig, I., Schagger, H. Advantages and limitations of clear-native PAGE. Proteomics. 5 (17), 4338-4346 (2005).
- Jungbauer, A., Hahn, R. Ion-exchange chromatography. Methods Enzymol. 463, 349-371 (2009).
- Yu, C. M., Mun, S., Wang, N. H. Theoretical analysis of the effects of reversible dimerization in size exclusion chromatography. J Chromatogr A. 1132 (1-2), 98-108 (2006).
- Giege, R. A historical perspective on protein crystallization from 1840 to the present day. FEBS J. 280 (24), 6456-6497 (2013).
- Lobley, A., Sadowski, M. I., Jones, D. T. pGenTHREADER and pDomTHREADER: new methods for improved protein fold recognition and superfamily discrimination. Bioinformatics. 25 (14), 1761-1767 (2009).
- Marsden, R. L., McGuffin, L. J., Jones, D. T. Rapid protein domain assignment from amino acid sequence using predicted secondary structure. Protein Sci. 11 (12), 2814-2824 (2002).
- Kelley, L. A., Mezulis, S., Yates, C. M., Wass, M. N., Sternberg, M. J. The Phyre2 web portal for protein modeling, prediction and analysis. Nat Protoc. 10 (6), 845-858 (2015).
- Elsliger, M. A., et al. The JCSG high-throughput structural biology pipeline. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 66 (Pt 10), 1137-1142 (2010).
- Bach, H., et al. Escherichia coli maltose-binding protein as a molecular chaperone for recombinant intracellular cytoplasmic single-chain antibodies. J Mol Biol. 312 (1), 79-93 (2001).
- Strong, M., et al. Toward the structural genomics of complexes: crystal structure of a PE/PPE protein complex from Mycobacterium tuberculosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (21), 8060-8065 (2006).
- Heras, B., Martin, J. L. Post-crystallization treatments for improving diffraction quality of protein crystals. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 61 (Pt 9), 1173-1180 (2005).
