Generando<em> De Novo</em> T humanas receptores de células específicas de antígeno por retroviral Transducción de Centric Hemichain
Summary
Aquí se describe un nuevo método para generar receptores de células T específicas de antígeno (TCR) por el emparejamiento de la TCRα o TCR de un TCR existente, que posee la especificidad de antígeno de interés, con hemichain complementaria del repertorio de receptores de células T periféricas. Los TCR de novo generados conservan especificidad de antígeno con afinidad variable.
Abstract
receptores de células T (TCR) se usan clínicamente para dirigir la especificidad de las células T para apuntar tumores como una modalidad prometedora de la inmunoterapia. Por lo tanto, la clonación de los TCR específicos para diferentes antígenos asociados a tumores ha sido el objetivo de muchos estudios. Para provocar una respuesta efectiva de células T, el TCR debe reconocer el antígeno diana con una afinidad óptima. Sin embargo, la clonación de tales TCR ha sido un reto y muchos disponibles TCR poseen afinidad sub-óptimo para el antígeno afín. En este protocolo, se describe un método de clonación de novo de alta afinidad TCR específicas de antígeno utilizando los TCR existentes mediante la explotación de la centralidad hemichain. Se sabe que para algunos TCR, cada TCRα o hemichain TCR no contribuyen por igual al reconocimiento de antígeno, y la hemichain dominante se refiere como la hemichain céntrica. Hemos demostrado que por el emparejamiento de la hemichain centrada con contra-cadenas diferentes de la cadena de conteo original, somos capaces de mantener el antígeno specificity, mientras que la modulación de su fuerza de interacción para el antígeno afín. Por lo tanto, el potencial terapéutico de un TCR dado se puede mejorar optimizando el emparejamiento entre los hemichains céntricas y de contador.
Introduction
receptores de células T (TCR) son receptores inmunes adaptativas heterodiméricas expresadas por los linfocitos T, compuestas de una cadena TCRα y TCR. Se generan mediante reordenación somática de V (D) J segmentos de genes, que produce un repertorio muy diverso capaz de reconocer configuraciones virtualmente ilimitado de complejos HLA / péptido. Clínicamente, las células T ingeniería genética para expresar clonotypic específica TCR para los antígenos asociados a tumores han demostrado eficacia en una variedad de cánceres 1. Sin embargo, muchos TCR clonados para este propósito carecen de suficiente afinidad por el antígeno de interés, que limitan su aplicación terapéutica.
A continuación, se describe un método para superar esta limitación de los TCR existentes mediante la explotación de la cadena de centralidad. Se ha informado de que uno hemichain TCR podría desempeñar un papel más dominante en el reconocimiento del antígeno diana 2, denominado aquí la centralidad. análisis estructurales de cristal han demostrado que uno centrado enhemichain de un TCR podría ser responsable de la mayoría de la huella en el MHC / péptido complejo 3,4. El uso de este concepto, hemos demostrado previamente que el SIG35α TCRα puede vincular con un repertorio diverso de las cadenas de TCR y mantener la reactividad contra el péptido MART1 27-35 presentado por HLA-A2 5. Se obtuvieron resultados similares con el TCR TAK1, donde la céntrica hemichain TCR emparejado con diversas cadenas TCRα y mantiene reactividad para el péptido WT1 235-243 presentado por HLA-A24 6. Tanto MART1 y WT1 son antígenos asociados a tumores. Cadena centralidad se aplicó también para estudiar el reconocimiento del antígeno del TCR restringidos por CD1d asesinas naturales invariantes (iNKT), por el emparejamiento de la cadena Vα24-Jα18 (Vα24i) TCRα invariante del TCR iNKT humanos con diferentes cadenas TCR Vβ11 7.
En todos los casos, hemos sido capaces de generar un repertorio de novo de los TCR por transducing la céntrica hemichain TCR de las células T de sangre periférica, donde el hemichain introducido junto con el TCRα endógena o TCR contra-cadenas. En esencia, el hemichain centrado sirve como un cebo que se puede utilizar para identificar los contra-cadenas adecuados, que cuando se combina en conjunto forman los TCR que mantienen la especificidad de antígeno de interés, sin embargo, que varían en afinidad. A partir de estos nuevos repertorios, hemos sido capaces de aislar los TCR clonotypic con una mejor interacción fuerza contra el antígeno diana en comparación con los TCR preexistentes. Por lo tanto, creemos que este método se acelerará la tubería de la identificación de los TCR óptimas para la aplicación clínica.
Protocol
Representative Results
Discussion
El primer requisito para la aplicación exitosa de este método está logrando suficiente eficacia de transducción de las células T primarias con el hemichain de interés. En nuestra experiencia, la combinación del uso de PG13 como línea celular de empaquetamiento y pMX como resultados de vectores retrovirales en la expresión estable y eficaz del gen introducido en las células T primarias humanas. células de empaquetamiento PG13 pueden ser de una sola célula clonada para seleccionar las células de empaquetado d…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIH grant R01 CA148673 (NH); the Ontario Institute for Cancer Research Clinical Investigator Award IA-039 (NH); BioCanRX Catalyst Grant (NH); The Princess Margaret Cancer Foundation (MOB, NH); Canadian Institutes of Health Research Canada Graduate Scholarship (TG); Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Postgraduate Scholarship (TG); Province of Ontario (TG, MA); and Guglietti Fellowship Award (TO). HLA and CD1d monomers were kindly provided by the NIH tetramer core facility.
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA | Wisent Bioproducts | 325-043-CL | |
| 293GPG cells | Generated by Ory et al. (ref 8) | ||
| Agar | Wisent Bioproducts | 800-010-CG | |
| Agarose | Wisent Bioproducts | 800-015-CG | |
| Ampicillin sodium salt | Wisent Bioproducts | 400-110-IG | |
| Chloroform | BioShop | CCL402 | |
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix | New England Biolabs | N0447L | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Life Technologies | 11995065 | |
| EcoRI | New England Biolabs | R0101S | |
| EZ-10 Spin Column DNA Gel Extraction Kit | BS353 | ||
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 12483020 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Filter | Corning | 431220 | 0.45 mm pore SFCA membrane |
| FITC-conjugated anti-human CD271 (NGFR) mAb | Biolegend | 345104 | clone ME20.4 |
| FITC-conjugated anti-human CD3 mAb | Biolegend | 300440 | clone UCHT1 |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750078 | |
| Gibson Assembly Master Mix | New England Biolabs | E2611L | used for multi-piece DNA assembly |
| HLA-A2 pentamer | Proimmune | depends on antigenic peptide | HLA-A2/MART1 multimer used here was purchased from Proimmune |
| HLA/CD1d monomers | NIH Tetramer Core Facility | multimerize monomers according to protocol provided by NIH tetramer core facility | |
| Human AB serum | Valley Biomedical | HP1022 | |
| human CD3 microbeads | Miltenyi Biotec | 130-050-101 | |
| IOTest Beta Mark TCR V beta Repertoire Kit | Beckman Coulter | IM3497 | |
| Jurkat 76 cells | Generated by Heemskerk et al. (ref 10) | ||
| LB Broth | Wisent Bioproducts | 800-060-LG | |
| LS MACS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| NEB 5-alpha Competent E. coli | New England Biolabs | C2987I | |
| NEBuffer 3.1 | New England Biolabs | B7203S | used for EcoRI and NotI digestion |
| NotI | New England Biolabs | R0189S | |
| NucleoBond Xtra Midi | Macherey-Nagel | 740410 | used for plasmid purification |
| PC5-conjugated anti-human CD8 mAb | Beckman Coulter | B21205 | clone B9.11 |
| PG13 cells | ATCC | CRL-10686 | |
| Phusion HF Buffer Pack | New England Biolabs | B0518S | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530L | |
| pMX retroviral vector | Cell Biolabs | RTV-010 | |
| polybrene | Sigma-Aldrich | H-9268 | |
| Proleukin (recombinant human interleukin-2) | Novartis | by Rx only | equivalent product can be purchased from Sigma-Aldrich |
| Purified anti-human CD3 antibody | Biolegend | 317301 | clone OKT3, used for T cell stimulation |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 11875119 | |
| SA-PE | Life Technologies | S866 | used for multimerizing monomers from NIH tetramer core facility |
| SMARTer RACE 5'/3' Kit | Clontech | 634858 | |
| Sterile water | Wisent Bioproducts | 809-115-LL | |
| SuperScript III First-Strand Synthesis System | Invitrogen | 18080051 | for cDNA synthesis |
| Syringe | BD | 301604 | 10 mL, slip tip |
| Tetracycline hydrochloride | Sigma-Aldrich | T7660 | |
| TransIT-293 | Mirus Bio | MIR 2700 | used to transfect 293GPG cells |
| TRIzol Reagent | Life Technologies | 15596026 |
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