Summary

Generando<em> De Novo</em> T humanas receptores de células específicas de antígeno por retroviral Transducción de Centric Hemichain

Published: October 25, 2016
doi:

Summary

Aquí se describe un nuevo método para generar receptores de células T específicas de antígeno (TCR) por el emparejamiento de la TCRα o TCR de un TCR existente, que posee la especificidad de antígeno de interés, con hemichain complementaria del repertorio de receptores de células T periféricas. Los TCR de novo generados conservan especificidad de antígeno con afinidad variable.

Abstract

receptores de células T (TCR) se usan clínicamente para dirigir la especificidad de las células T para apuntar tumores como una modalidad prometedora de la inmunoterapia. Por lo tanto, la clonación de los TCR específicos para diferentes antígenos asociados a tumores ha sido el objetivo de muchos estudios. Para provocar una respuesta efectiva de células T, el TCR debe reconocer el antígeno diana con una afinidad óptima. Sin embargo, la clonación de tales TCR ha sido un reto y muchos disponibles TCR poseen afinidad sub-óptimo para el antígeno afín. En este protocolo, se describe un método de clonación de novo de alta afinidad TCR específicas de antígeno utilizando los TCR existentes mediante la explotación de la centralidad hemichain. Se sabe que para algunos TCR, cada TCRα o hemichain TCR no contribuyen por igual al reconocimiento de antígeno, y la hemichain dominante se refiere como la hemichain céntrica. Hemos demostrado que por el emparejamiento de la hemichain centrada con contra-cadenas diferentes de la cadena de conteo original, somos capaces de mantener el antígeno specificity, mientras que la modulación de su fuerza de interacción para el antígeno afín. Por lo tanto, el potencial terapéutico de un TCR dado se puede mejorar optimizando el emparejamiento entre los hemichains céntricas y de contador.

Introduction

receptores de células T (TCR) son receptores inmunes adaptativas heterodiméricas expresadas por los linfocitos T, compuestas de una cadena TCRα y TCR. Se generan mediante reordenación somática de V (D) J segmentos de genes, que produce un repertorio muy diverso capaz de reconocer configuraciones virtualmente ilimitado de complejos HLA / péptido. Clínicamente, las células T ingeniería genética para expresar clonotypic específica TCR para los antígenos asociados a tumores han demostrado eficacia en una variedad de cánceres 1. Sin embargo, muchos TCR clonados para este propósito carecen de suficiente afinidad por el antígeno de interés, que limitan su aplicación terapéutica.

A continuación, se describe un método para superar esta limitación de los TCR existentes mediante la explotación de la cadena de centralidad. Se ha informado de que uno hemichain TCR podría desempeñar un papel más dominante en el reconocimiento del antígeno diana 2, denominado aquí la centralidad. análisis estructurales de cristal han demostrado que uno centrado enhemichain de un TCR podría ser responsable de la mayoría de la huella en el MHC / péptido complejo 3,4. El uso de este concepto, hemos demostrado previamente que el SIG35α TCRα puede vincular con un repertorio diverso de las cadenas de TCR y mantener la reactividad contra el péptido MART1 27-35 presentado por HLA-A2 5. Se obtuvieron resultados similares con el TCR TAK1, donde la céntrica hemichain TCR emparejado con diversas cadenas TCRα y mantiene reactividad para el péptido WT1 235-243 presentado por HLA-A24 6. Tanto MART1 y WT1 son antígenos asociados a tumores. Cadena centralidad se aplicó también para estudiar el reconocimiento del antígeno del TCR restringidos por CD1d asesinas naturales invariantes (iNKT), por el emparejamiento de la cadena Vα24-Jα18 (Vα24i) TCRα invariante del TCR iNKT humanos con diferentes cadenas TCR Vβ11 7.

En todos los casos, hemos sido capaces de generar un repertorio de novo de los TCR por transducing la céntrica hemichain TCR de las células T de sangre periférica, donde el hemichain introducido junto con el TCRα endógena o TCR contra-cadenas. En esencia, el hemichain centrado sirve como un cebo que se puede utilizar para identificar los contra-cadenas adecuados, que cuando se combina en conjunto forman los TCR que mantienen la especificidad de antígeno de interés, sin embargo, que varían en afinidad. A partir de estos nuevos repertorios, hemos sido capaces de aislar los TCR clonotypic con una mejor interacción fuerza contra el antígeno diana en comparación con los TCR preexistentes. Por lo tanto, creemos que este método se acelerará la tubería de la identificación de los TCR óptimas para la aplicación clínica.

Protocol

1. Preparación retroviral construcción que codifica TCR Hemichain de interés Linealizar pMX vector para permitir la inserción de un gen TCR en los pasos posteriores. Digerir el DNA plásmido con enzimas de restricción EcoRI y NotI a 37 ° C durante 3 horas (Tabla 1) 8. Llevar a cabo la electroforesis del plásmido digerido en gel de agarosa al 1,2%. Impuestos Especiales de la banda de aproximadamente 4.500 pares de bases (pb), y eluyen en 30 l de agua estéril usando…

Representative Results

Sin el conocimiento previo de los cuales es hemichain cadena centrada, la cadena TCRα y TCR debe ser clonado y transduce a las células T de sangre periférica, que fue hecho en el caso de HLA-A24 / WT1 reactiva TAK1 TCR (Figura 1) por separado. Transducción de TAK1β dio una frecuencia notablemente más alto de las células T específicas de antígeno. Por el contrario, transducción de una hemichain no centrado no cedería células T positivas multímero de novo,…

Discussion

El primer requisito para la aplicación exitosa de este método está logrando suficiente eficacia de transducción de las células T primarias con el hemichain de interés. En nuestra experiencia, la combinación del uso de PG13 como línea celular de empaquetamiento y pMX como resultados de vectores retrovirales en la expresión estable y eficaz del gen introducido en las células T primarias humanas. células de empaquetamiento PG13 pueden ser de una sola célula clonada para seleccionar las células de empaquetado d…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by NIH grant R01 CA148673 (NH); the Ontario Institute for Cancer Research Clinical Investigator Award IA-039 (NH); BioCanRX Catalyst Grant (NH); The Princess Margaret Cancer Foundation (MOB, NH); Canadian Institutes of Health Research Canada Graduate Scholarship (TG); Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Postgraduate Scholarship (TG); Province of Ontario (TG, MA); and Guglietti Fellowship Award (TO). HLA and CD1d monomers were kindly provided by the NIH tetramer core facility.

Materials

0.05% Trypsin-EDTA Wisent Bioproducts 325-043-CL
293GPG cells Generated by Ory et al. (ref 8)
Agar Wisent Bioproducts 800-010-CG
Agarose Wisent Bioproducts 800-015-CG
Ampicillin sodium salt Wisent Bioproducts 400-110-IG
Chloroform BioShop CCL402
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix New England Biolabs N0447L
DMEM, high glucose, pyruvate Life Technologies 11995065
EcoRI New England Biolabs R0101S
EZ-10 Spin Column DNA Gel Extraction Kit BS353
Fetal Bovine Serum Life Technologies 12483020
Ficoll-Paque Plus GE Healthcare 17-1440-02
Filter Corning 431220 0.45 mm pore SFCA membrane
FITC-conjugated anti-human CD271 (NGFR) mAb Biolegend 345104 clone ME20.4
FITC-conjugated anti-human CD3 mAb Biolegend 300440 clone UCHT1
Gentamicin Life Technologies 15750078
Gibson Assembly Master Mix New England Biolabs E2611L used for multi-piece DNA assembly
HLA-A2 pentamer Proimmune depends on antigenic peptide HLA-A2/MART1 multimer used here was purchased from Proimmune
HLA/CD1d monomers NIH Tetramer Core Facility multimerize monomers according to protocol provided by NIH tetramer core facility
Human AB serum Valley Biomedical HP1022
human CD3 microbeads Miltenyi Biotec 130-050-101
IOTest Beta Mark TCR V beta Repertoire Kit Beckman Coulter IM3497
Jurkat 76 cells Generated by Heemskerk et al. (ref 10)
LB Broth Wisent Bioproducts 800-060-LG
LS MACS column Miltenyi Biotec 130-042-401
NEB 5-alpha Competent E. coli New England Biolabs C2987I
NEBuffer 3.1 New England Biolabs B7203S used for EcoRI and NotI digestion
NotI New England Biolabs R0189S
NucleoBond Xtra Midi Macherey-Nagel 740410 used for plasmid purification
PC5-conjugated anti-human CD8 mAb Beckman Coulter B21205 clone B9.11
PG13 cells ATCC CRL-10686
Phusion HF Buffer Pack New England Biolabs B0518S
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase New England Biolabs M0530L
pMX retroviral vector Cell Biolabs RTV-010
polybrene Sigma-Aldrich H-9268
Proleukin (recombinant human interleukin-2) Novartis by Rx only equivalent product can be purchased from Sigma-Aldrich
Purified anti-human CD3 antibody Biolegend 317301 clone OKT3, used for T cell stimulation
RPMI 1640 Life Technologies 11875119
SA-PE Life Technologies S866 used for multimerizing monomers from NIH tetramer core facility
SMARTer RACE 5'/3'  Kit Clontech 634858
Sterile water Wisent Bioproducts 809-115-LL
SuperScript III First-Strand Synthesis System Invitrogen 18080051 for cDNA synthesis
Syringe BD 301604 10 mL, slip tip
Tetracycline hydrochloride Sigma-Aldrich T7660
TransIT-293 Mirus Bio MIR 2700 used to transfect 293GPG cells
TRIzol Reagent Life Technologies 15596026

Referencias

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Citar este artículo
Guo, T., Ochi, T., Nakatsugawa, M., Kagoya, Y., Anczurowski, M., Wang, C., Rahman, M. A., Saso, K., Butler, M. O., Hirano, N. Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain. J. Vis. Exp. (116), e54697, doi:10.3791/54697 (2016).

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