Summary

생성<em> 드 노보</em> 중심 Hemichain의 레트로 바이러스 형질 도입에 의해 항원 특이 적 인간 T 세포 수용체

Published: October 25, 2016
doi:

Summary

여기서 우리는, 기존 TCR의 TCRα 또는 TCRβ 페어링 말초 T 세포 수용체 레퍼토리 상보 hemichain으로 관심 항원 특이성을 보유하여 항원 특이 적 T 세포 수용체 (TCR도)을 생성하는 신규 한 방법을 설명한다. 드 노보 생성 TCR도 선호도 변화와 항원 특이성을 유지한다.

Abstract

T 세포 수용체 (TCR도)의 면역 요법의 유망 양상으로 종양 타겟팅 T 세포의 특이성을 직접 임상 사용된다. 따라서, 다양한 종양 관련 항원에 대한 특정 복제 TCR도 많은 연구의 목표였다. 효과적인 T 세포 반응을 유도하기 위해, TCR 최적 친화력 표적 항원을 인식해야한다. 그러나, 복제 등의 TCR도는 도전과 많은 사용할 수 TCR도하고 동족 항원에 대한 차선의 친 화성을 가지고있다. 이 프로토콜에서는, 우리는 hemichain의 중심성을 이용하여 기존 TCR도를 사용하여 드 노보 선호도가 높은 항원 특이 TCR도를 복제하는 방법을 설명합니다. 이는 일부 TCR도, 각 TCRα 또는 TCRβ hemichain의 항원 인식에 동일하게 기여하지 않는 것으로 알려져 있으며, 지배적 hemichain는 중심 hemichain로 지칭된다. 우리는 원래 반 체인에서 다른 반 체인으로 중심 hemichain 페어링하여, 우리는 항원의를 유지할 수 있음을 보여 주었다pecificity, 동족 항원 상호 작용의 강도를 조절하면서. 따라서, 주어진 TCR의 치료 가능성은 중심과 대향 hemichains 사이의 페어링을 최적화함으로써 개선 될 수있다.

Introduction

T 세포 수용체 (TCR도)는 TCRα 및 TCRβ 쇄로 이루어지는 T 림프구에 의해 발현 이종 적응 면역 수용체이다. 그들은 HLA / 펩타이드 복합체의 거의 무한대의 구성을 인식 할 수있는 매우 다양한 레퍼토리를 생산 V (D) J 유전자 세그먼트의 체세포 재 배열을 통해 생성된다. 임상 종양 관련 항원에 대한 clonotypic TCR도의 특정을 발현하도록 유전자 조작 된 T 세포는 암 (1)의 다양한 효능을 증명하고있다. 그러나, 이러한 목적을 위해 많은 클론 TCR도 그들의 치료 학적 적용을 제한 관심있는 항원에 충분한 친 화성이 부족하다.

여기서는 체인 중심성을 이용하여 기존의 TCR도이 제한을 극복하는 방법을 설명한다. 그것은 하나의 TCR의 hemichain는 표적 항원이 인식에서 더 지배적 인 역할을 할 수 있다고보고되고있다, 여기 중심성 불린다. 크리스탈 구조 분석은 하나의 중심을 보여 주었다TCR의 hemichain는 3,4 복잡 MHC / 펩타이드의 공간의 대부분을 설명 할 수있다. 이 개념을 사용하여, 우리는 이전에 SIG35α TCRα가 TCRβ 체인의 다양한 레퍼토리와 페어링 및 HLA-A2 (5)에 의해 제시된 MART1 27-35 펩타이드에 대한 반응성을 유지할 수 있음을 증명하고있다. 유사한 결과는 중심 TCRβ의 hemichain 다양한 TCRα 사슬과 페어링 및 HLA-A24 (6)에 의해 제공되는 WT1 펩티드 235-243 반응성을 유지 TAK1 TCR로 얻었다. MART1 및 WT1 모두 종양 관련 항원이다. 체인 중심성은 다른 Vβ11 TCRβ 체인 (7) 인간하여 iNKT TCR도의 불변 Vα24-Jα18 (Vα24i) TCRα 체인을 페어링하여, CD1d 제한 불변 자연 살해 (인 iNKT) TCR도의 항원 인식을 연구하기 위해 적용되었다.

모든 경우에서는 트랜스로 TCR도의 드 노보 레퍼토리를 생성 할 수 있었다도입 hemichain이 내생 TCRα 또는 TCRβ 카운터 사슬와 결합 말초 혈액 T 세포에 중심 TCR의 hemichain를으로 줄. 본질적으로, 중심 hemichain 함께 쌍으로 관심의 항원 특이성을 유지 TCR도 형성하면서도 친 화성 변화 적절한 이의 사슬을 식별하는데 사용될 수있는 미끼로서 기능한다. 이러한 신규 레퍼토리에서, 우리는 기존에 비하여 TCR도 표적 항원에 대해 향상된 상호 작용 강도 clonotypic TCR도를 분리 할 수 ​​있었다. 따라서, 우리는이 방법이 임상 응용 프로그램에 대한 최적의 TCR도를 식별하는 파이프 라인을 가속화 할 전망이다.

Protocol

1. 레트로 바이러스가 관심의 인코딩 TCR Hemichain를 구축 준비 후속 단계에서 TCR 유전자의 삽입을 허용하도록 PMX 벡터 선형화. 3 시간 동안 37 ° C (표 1)에 제한 효소 EcoRI과 NotI을 제한 효소로 플라스미드 DNA를 소화 8. 1.2 % 아가 로스 겔에 소화 플라스미드의 전기 영동을 수행하십시오. 소비세 약 4,500 염기쌍 (BPS)의 밴드 및 용출은 30 ㎕의 멸균 수에 시판 겔 추출 키…

Representative Results

사전 지식없이하는 hemichain의 TCRα 및 TCRβ 체인은 별도 복제 및 HLA-A24 / WT1 반응 TAK1 TCR (그림 1)의 경우에 이루어졌다 말초 혈액 T 세포에 형질 도입해야 체인 중심이다. TAK1β의 전달은 항원 특이 적 T 세포의 현저히 더 높은 주파수를 수득 하였다. 반대로, 비 중심 hemichain의 전달은 드 노보 합체 양성 T 세포 TAK1α 체인 것과 같이 (도 1)를 산출하…

Discussion

이 방법을 성공적으로 적용하는 첫 번째 요건은 관심 hemichain 일차 T 세포의 충분한 전달 효율을 달성한다. 경험 인간 T 세포 주에서 도입 유전자의 안정하고 효율적인 발현 레트로 바이러스 벡터의 결과로서 패키징 세포주와 PMX로서 PG13를 사용하는 조합. PG13 패키징 세포는 형질 도입 효율을 향상시키는 고역가 포장 셀 선택 클로닝 단일 셀 수있다. 또한, T 세포 증식은 또한 레트로 바이러스에 의?…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by NIH grant R01 CA148673 (NH); the Ontario Institute for Cancer Research Clinical Investigator Award IA-039 (NH); BioCanRX Catalyst Grant (NH); The Princess Margaret Cancer Foundation (MOB, NH); Canadian Institutes of Health Research Canada Graduate Scholarship (TG); Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Postgraduate Scholarship (TG); Province of Ontario (TG, MA); and Guglietti Fellowship Award (TO). HLA and CD1d monomers were kindly provided by the NIH tetramer core facility.

Materials

0.05% Trypsin-EDTA Wisent Bioproducts 325-043-CL
293GPG cells Generated by Ory et al. (ref 8)
Agar Wisent Bioproducts 800-010-CG
Agarose Wisent Bioproducts 800-015-CG
Ampicillin sodium salt Wisent Bioproducts 400-110-IG
Chloroform BioShop CCL402
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix New England Biolabs N0447L
DMEM, high glucose, pyruvate Life Technologies 11995065
EcoRI New England Biolabs R0101S
EZ-10 Spin Column DNA Gel Extraction Kit BS353
Fetal Bovine Serum Life Technologies 12483020
Ficoll-Paque Plus GE Healthcare 17-1440-02
Filter Corning 431220 0.45 mm pore SFCA membrane
FITC-conjugated anti-human CD271 (NGFR) mAb Biolegend 345104 clone ME20.4
FITC-conjugated anti-human CD3 mAb Biolegend 300440 clone UCHT1
Gentamicin Life Technologies 15750078
Gibson Assembly Master Mix New England Biolabs E2611L used for multi-piece DNA assembly
HLA-A2 pentamer Proimmune depends on antigenic peptide HLA-A2/MART1 multimer used here was purchased from Proimmune
HLA/CD1d monomers NIH Tetramer Core Facility multimerize monomers according to protocol provided by NIH tetramer core facility
Human AB serum Valley Biomedical HP1022
human CD3 microbeads Miltenyi Biotec 130-050-101
IOTest Beta Mark TCR V beta Repertoire Kit Beckman Coulter IM3497
Jurkat 76 cells Generated by Heemskerk et al. (ref 10)
LB Broth Wisent Bioproducts 800-060-LG
LS MACS column Miltenyi Biotec 130-042-401
NEB 5-alpha Competent E. coli New England Biolabs C2987I
NEBuffer 3.1 New England Biolabs B7203S used for EcoRI and NotI digestion
NotI New England Biolabs R0189S
NucleoBond Xtra Midi Macherey-Nagel 740410 used for plasmid purification
PC5-conjugated anti-human CD8 mAb Beckman Coulter B21205 clone B9.11
PG13 cells ATCC CRL-10686
Phusion HF Buffer Pack New England Biolabs B0518S
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase New England Biolabs M0530L
pMX retroviral vector Cell Biolabs RTV-010
polybrene Sigma-Aldrich H-9268
Proleukin (recombinant human interleukin-2) Novartis by Rx only equivalent product can be purchased from Sigma-Aldrich
Purified anti-human CD3 antibody Biolegend 317301 clone OKT3, used for T cell stimulation
RPMI 1640 Life Technologies 11875119
SA-PE Life Technologies S866 used for multimerizing monomers from NIH tetramer core facility
SMARTer RACE 5'/3'  Kit Clontech 634858
Sterile water Wisent Bioproducts 809-115-LL
SuperScript III First-Strand Synthesis System Invitrogen 18080051 for cDNA synthesis
Syringe BD 301604 10 mL, slip tip
Tetracycline hydrochloride Sigma-Aldrich T7660
TransIT-293 Mirus Bio MIR 2700 used to transfect 293GPG cells
TRIzol Reagent Life Technologies 15596026

Referencias

  1. Maus, M. V., et al. Adoptive immunotherapy for cancer or viruses. Annu. Rev. Immunol. 32, 189-225 (2014).
  2. Yokosuka, T., , ., et al. Predominant role of T cell receptor (TCR)-alpha chain in forming preimmune TCR repertoire revealed by clonal TCR reconstitution system. J.Exp.Med. 195, 991-1001 (2002).
  3. Rudolph, M. G., Stanfield, R. L., Wilson, I. A. How TCRs bind MHCs, peptides, and coreceptors. Annu. Rev. Immunol. 24, 419-466 (2006).
  4. Shimizu, A., et al. Structure of TCR and antigen complexes at an immunodominant CTL epitope in HIV-1 infection. Sci. Rep. 3, 3097 (2013).
  5. Nakatsugawa, M., et al. Specific roles of each TCR hemichain in generating functional chain-centric TCR. J. Immunol. 194 (7), 3487-3500 (2015).
  6. Ochi, T., et al. Optimization of T-cell Reactivity by Exploiting TCR Chain Centricity for the Purpose of Safe and Effective Antitumor TCR Gene Therapy. Cancer Immunol. Res. 3 (9), 1070-1081 (2015).
  7. Chamoto, K., et al. CDR3beta sequence motifs regulate autoreactivity of human invariant NKT cell receptors. J. Autoimmun. 68, 39-51 (2016).
  8. Grozdanov, P. N., MacDonald, C. C. Generation of plasmid vectors expressing FLAG-tagged proteins under the regulation of human Elongation Factor-1α promoter using Gibson Assembly. J. Vis. Exp. (96), e52235 (2015).
  9. Beshiri, M. L., et al. Genome-wide analysis using ChIP to identify isoform-specific gene targets. J. Vis. Exp. (41), e2101 (2010).
  10. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat. Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  11. Johnson, D., et al. Expression and structure of the human NGF receptor. Cell. 47 (4), 545-554 (1986).
  12. Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PloS one. 6, e18556 (2011).
  13. Yang, S., et al. Development of optimal bicistronic lentiviral vectors facilitates high-level TCR gene expression and robust tumor cell recognition. Gene Ther. 15 (21), 1411-1423 (2008).
  14. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J. Vis. Exp. (6), e253 (2007).
  15. Birnboim, H. C., Doly, J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res. 7 (6), 1513-1523 (1979).
  16. Ory, D. S., Neugeboren, B. A., Mulligan, R. C. A stable human-derived packaging cell line for production of high titer retrovirus/vesicular stomatitis virus G pseudotypes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93 (21), 11400-11406 (1996).
  17. Imataki, O., et al. IL-21 can supplement suboptimal Lck-independent MAPK activation in a STAT-3-dependent manner in human CD8(+) T cells. J. Immunol. 188 (4), 1609-1619 (2012).
  18. Davies, J. K., Barbon, C. M., Voskertchian, A. R., Nadler, L. M., Guinan, E. C. Induction of alloantigen-specific anergy in human peripheral blood mononuclear cells by alloantigen stimulation with co-stimulatory signal blockade. J. Vis. Exp. (49), e2673 (2011).
  19. Butcher, M. J., Herre, M., Ley, K., Galkina, E. Flow cytometry analysis of immune cells within murine aortas. J. Vis. Exp. (53), e2848 (2011).
  20. Butler, M. O., et al. Establishment of antitumor memory in humans using in vitro-educated CD8+ T cells. Sci. Transl. Med. 3 (80), 80ra34 (2011).
  21. Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. Biochem. 162 (1), 156-159 (1987).
  22. Peterson, S. M., Freeman, J. L. RNA isolation from embryonic zebrafish and cDNA synthesis for gene expression analysis. J. Vis. Exp. (30), e1470 (2009).
  23. Ying, S. Y., Ying, S. Y. Complementary DNA Libraries. Generation of cDNA Libraries: Methods and Protocols. 221, 1-12 (2003).
  24. Hirano, N., et al. Engagement of CD83 ligand induces prolonged expansion of CD8+ T cells and preferential enrichment for antigen specificity. Blood. 107 (4), 1528-1536 (2006).
  25. Scotto-Lavino, E., Du, G., Frohman, M. A. 5′ end cDNA amplification using classic RACE. Nat. Protoc. 1 (6), 2555-2562 (2006).
  26. Heemskerk, M. H., et al. Redirection of antileukemic reactivity of peripheral T lymphocytes using gene transfer of minor histocompatibility antigen HA-2-specific T-cell receptor complexes expressing a conserved alpha joining region. Blood. 102 (10), 3530-3540 (2003).
  27. Yan, H., et al. Magnetic cell sorting and flow cytometry sorting methods for the isolation and function analysis of mouse CD4+ CD25+ Treg cells. J. Zhejiang Univ. Sci. B. 10, 928-932 (2009).
  28. Padovan, E., et al. Expression of two T cell receptor alpha chains: dual receptor T cells. Science. 262 (5132), 422-424 (1993).
  29. Johnson, L. A., et al. transfer of tumor-reactive TCR confers both high avidity and tumor reactivity to nonreactive peripheral blood mononuclear cells and tumor-infiltrating lymphocytes. J. Immunol. 177 (9), 6548-6559 (2006).
  30. Chinnasamy, N., et al. A TCR targeting the HLA-A*0201-restricted epitope of MAGE-A3 recognizes multiple epitopes of the MAGE-A antigen superfamily in several types of cancer. J. Immunol. 186 (2), 685-696 (2011).

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Citar este artículo
Guo, T., Ochi, T., Nakatsugawa, M., Kagoya, Y., Anczurowski, M., Wang, C., Rahman, M. A., Saso, K., Butler, M. O., Hirano, N. Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain. J. Vis. Exp. (116), e54697, doi:10.3791/54697 (2016).

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