Summary

生成<em>デ・ノボ</em>センHemichainのレトロウイルス形質導入によって抗原特異的ヒトT細胞受容体

Published: October 25, 2016
doi:

Summary

本明細書において、我々は、末梢T細胞受容体レパートリーの相補hemichainと、関心対象の抗原特異性を有する、既存のTCRのTCRα又はTCRβをペアリングすることにより、抗原特異的T細胞受容体(TCR)を生成する新規な方法を記載します。 デノボ生成されたTCRは、親和性を変化させて、抗原特異性を保持します。

Abstract

T細胞受容体(TCR)は、免疫療法の有望なモダリティとして腫瘍を標的とするT細胞の特異性を指示するために臨床的に使用されます。そのため、様々な腫瘍関連抗原に特異的なTCRをクローニングすることは、多くの研究の目標でした。効果的なT細胞応答を誘発するために、TCRは、最適な親和性で標的抗原を認識しなければなりません。しかし、このようなTCRをクローニングすることが課題と多くの利用可能なのTCR同族抗原に対する準最適な親和性を有するとなっています。このプロトコルでは、我々はhemichain中心主義を利用することによって、既存のTCRを使用してデノボ高親和性抗原特異的TCRをクローン化する方法について説明します。いくつかのTCRのために、それぞれのTCRα又はTCRβのhemichainは抗原認識に等しく寄与しないことが知られており、ドミナントhemichainを中心hemichainと呼ばれます。我々はオリジナルのカウンターチェーンは異なるカウンター鎖を有する中心のhemichainを組み合わせることで、我々は抗原秒を維持することが可能であることが示されていますpecificity、同族抗原に対するその相互作用の強度を変調しながら。したがって、所与のTCRの治療可能性を中心とカウンタhemichains間の対形成を最適化することによって改善することができます。

Introduction

T細胞受容体(TCR)は、TCRαおよびTCRβ鎖からなるTリンパ球によって発現されるヘテロ二適応免疫受容体です。これらは、HLA /ペプチド複合体の実質的に無制限の構成を認識することができる非常に多様なレパートリーを産生するV(D)J遺伝子セグメントの体細胞再編成によって生成されます。臨床的には、腫瘍関連抗原に特異的なクローン型TCRを発現するように操作されたT細胞は癌1の様々な有効性が実証されています。しかし、この目的のためにクローニングされた多くのTCRは、それらの治療的適用を制限する目的の抗原に対して十分な親和性を欠いています。

ここでは、チェーン中心主義を利用することにより、既存のTCRのためにこの制限を克服する方法を説明します。それは1のTCR hemichainは、標的抗原2の認識で、より支配的な役割を果たし得ることが報告されている、ここでは中心主義と呼ばれます。結晶構造解析は、その1中心を示していますTCRのhemichainは3,4 MHC /ペプチド複合体上のフットプリントの大部分を占める可能性があります。この概念を使用して、我々は以前にSIG35αTCRαがTCRβ鎖の多様なレパートリーと対HLA-A2 5により提示MART1 27-35ペプチドに対する反応性を維持することができることを実証しました。同様の結果が中心TCRβのhemichainは、様々なTCRα鎖と対にし、HLA-A24 6により提示WT1 235-243ペプチドについて反応性を維持しTAK1 TCRで得られました。 MART1およびWT1の両方が腫瘍関連抗原です。チェーン中心主義は、異なるVβ11TCRβ鎖7を有するヒトのiNKT TCRの不変Vα24-Jα18(Vα24i)TCRα鎖を組み合わせることで、CD1d拘束不変ナチュラルキラー(iNKT細胞)TCRの抗原認識を研究するために適用されました。

全ての場合において、我々は、トランスによってTCRのデノボレパートリーを生成することができました導入hemichainが内因性TCRαまたはTCRβカウンター鎖と対になった末梢血T細胞、に中心のTCRのhemichainをducing。本質的には、中心hemichainは一緒に対に適切なカウンタ鎖を同定するために用いることができるベイトとして機能まだ親和性が異なる、目的の抗原特異性を維持するTCRを形成します。これらの新規レパートリーから、我々は既存のTCRと比較して、標的抗原に対する改善された相互作用の強度を有するクローン型TCRを単離することができました。したがって、我々は、この方法は、臨床応用のための最適なTCRを特定のパイプラインを加速すると考えています。

Protocol

1.レトロウイルスは、利息のエンコーディングTCR Hemichainを構築する準備以降のTCR遺伝子の挿入を可能にするようにするpMXベクターを線状化。 3時間37℃( 表1)にEcoRIおよびNotI制限酵素でプラスミドDNAを消化8。 1.2%アガロースゲル上で消化されたプラスミドの電気泳動を行います。物品は約4,500塩基対(BPS)のバンド、および市販のゲル抽出キット9を</…

Representative Results

チェーン中心であるhemichainの予備知識なしに、TCRα及びTCRβ鎖を別々にクローン化されるべきであり、HLA-A24 / WT1反応TAK1 TCR( 図1)の場合に行われた末梢血T細胞への形質導入します。 TAK1βの形質導入は、抗原特異的T細胞の顕著に高い頻度が得られました。逆に、非中心hemichainの形質導入は、TAK1α鎖( 図1)で見られるように、 デノボ多…

Discussion

この方法の成功した適用のための最初の要件は、関心のhemichain一次T細胞の十分な変換効率を達成することです。我々の経験、ヒト一次T細胞における導入遺伝子の安定的かつ効率的な発現のレトロウイルスベクターの結果として、パッケージング細胞株とするpMXとしてPG13を用いて組み合わせました。 PG13パッケージング細胞を形質導入効率を向上させるために高力価のパッケージング細胞を?…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by NIH grant R01 CA148673 (NH); the Ontario Institute for Cancer Research Clinical Investigator Award IA-039 (NH); BioCanRX Catalyst Grant (NH); The Princess Margaret Cancer Foundation (MOB, NH); Canadian Institutes of Health Research Canada Graduate Scholarship (TG); Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Postgraduate Scholarship (TG); Province of Ontario (TG, MA); and Guglietti Fellowship Award (TO). HLA and CD1d monomers were kindly provided by the NIH tetramer core facility.

Materials

0.05% Trypsin-EDTA Wisent Bioproducts 325-043-CL
293GPG cells Generated by Ory et al. (ref 8)
Agar Wisent Bioproducts 800-010-CG
Agarose Wisent Bioproducts 800-015-CG
Ampicillin sodium salt Wisent Bioproducts 400-110-IG
Chloroform BioShop CCL402
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix New England Biolabs N0447L
DMEM, high glucose, pyruvate Life Technologies 11995065
EcoRI New England Biolabs R0101S
EZ-10 Spin Column DNA Gel Extraction Kit BS353
Fetal Bovine Serum Life Technologies 12483020
Ficoll-Paque Plus GE Healthcare 17-1440-02
Filter Corning 431220 0.45 mm pore SFCA membrane
FITC-conjugated anti-human CD271 (NGFR) mAb Biolegend 345104 clone ME20.4
FITC-conjugated anti-human CD3 mAb Biolegend 300440 clone UCHT1
Gentamicin Life Technologies 15750078
Gibson Assembly Master Mix New England Biolabs E2611L used for multi-piece DNA assembly
HLA-A2 pentamer Proimmune depends on antigenic peptide HLA-A2/MART1 multimer used here was purchased from Proimmune
HLA/CD1d monomers NIH Tetramer Core Facility multimerize monomers according to protocol provided by NIH tetramer core facility
Human AB serum Valley Biomedical HP1022
human CD3 microbeads Miltenyi Biotec 130-050-101
IOTest Beta Mark TCR V beta Repertoire Kit Beckman Coulter IM3497
Jurkat 76 cells Generated by Heemskerk et al. (ref 10)
LB Broth Wisent Bioproducts 800-060-LG
LS MACS column Miltenyi Biotec 130-042-401
NEB 5-alpha Competent E. coli New England Biolabs C2987I
NEBuffer 3.1 New England Biolabs B7203S used for EcoRI and NotI digestion
NotI New England Biolabs R0189S
NucleoBond Xtra Midi Macherey-Nagel 740410 used for plasmid purification
PC5-conjugated anti-human CD8 mAb Beckman Coulter B21205 clone B9.11
PG13 cells ATCC CRL-10686
Phusion HF Buffer Pack New England Biolabs B0518S
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase New England Biolabs M0530L
pMX retroviral vector Cell Biolabs RTV-010
polybrene Sigma-Aldrich H-9268
Proleukin (recombinant human interleukin-2) Novartis by Rx only equivalent product can be purchased from Sigma-Aldrich
Purified anti-human CD3 antibody Biolegend 317301 clone OKT3, used for T cell stimulation
RPMI 1640 Life Technologies 11875119
SA-PE Life Technologies S866 used for multimerizing monomers from NIH tetramer core facility
SMARTer RACE 5'/3'  Kit Clontech 634858
Sterile water Wisent Bioproducts 809-115-LL
SuperScript III First-Strand Synthesis System Invitrogen 18080051 for cDNA synthesis
Syringe BD 301604 10 mL, slip tip
Tetracycline hydrochloride Sigma-Aldrich T7660
TransIT-293 Mirus Bio MIR 2700 used to transfect 293GPG cells
TRIzol Reagent Life Technologies 15596026

Referencias

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Guo, T., Ochi, T., Nakatsugawa, M., Kagoya, Y., Anczurowski, M., Wang, C., Rahman, M. A., Saso, K., Butler, M. O., Hirano, N. Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain. J. Vis. Exp. (116), e54697, doi:10.3791/54697 (2016).

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