Summary

Generazione<em> De Novo</em> Antigene-specifici T umana recettori cellulari di trasduzione retrovirale di Centric Hemichain

Published: October 25, 2016
doi:

Summary

Qui si descrive un nuovo metodo per generare recettori delle cellule T antigene-specifiche (TCR) accoppiando la TCRα o TCRβ di un TCR esistente, che possiede l'antigene-specificità di interesse, con hemichain complementare del T periferico recettore delle cellule repertorio. I TCR de novo generati conservano antigene-specificità con vari affinità.

Abstract

recettori delle cellule T (TCR) sono utilizzati clinicamente per dirigere la specificità delle cellule T a colpire i tumori come modalità promettente di immunoterapia. Pertanto, TCR clonazione specifici per diversi antigeni associati al tumore è stato l'obiettivo di molti studi. Per suscitare una risposta delle cellule T efficace, il TCR deve riconoscere l'antigene bersaglio con affinità ottimale. Tuttavia, la clonazione come TCR è stata una sfida e molti disponibili TCR possedere affinità sub-ottimale per l'antigene cognate. In questo protocollo, si descrive un metodo di clonazione de novo ad alta affinità TCR antigene-specifiche che utilizzano TCR esistenti sfruttando hemichain centralità. È noto che per alcuni TCR, ogni TCRα o TCRβ hemichain non contribuiscono ugualmente al riconoscimento dell'antigene, e il hemichain dominante è indicato come il hemichain centric. Abbiamo dimostrato che accoppiando il hemichain centrica con contro-catene differenti dal contatore-catena originale, siamo in grado di mantenere l'antigene specificity, mentre modulando la sua forza di interazione per l'antigene cognate. Pertanto, il potenziale terapeutico di un dato TCR può essere migliorata ottimizzando l'accoppiamento tra le centric e contro hemichains.

Introduction

recettori delle cellule T (TCR) sono eterodimeriche recettori immunitarie adattative espressi dai linfociti T, composto da una catena TCRα e TCRβ. Essi sono generati mediante riarrangiamento somatica di V (D) J segmenti genici, che produce un repertorio altamente diversificata capace di riconoscere configurazioni praticamente illimitata di complessi HLA / peptide. Clinicamente, cellule T ingegnerizzate per esprimere clonotypic specifico TCR per antigeni tumore-associati hanno dimostrato l'efficacia in una varietà di tumori 1. Tuttavia, molti TCR clonati per questo scopo non hanno sufficiente affinità per l'antigene di interesse, che limitano la loro applicazione terapeutica.

Qui, descriviamo un metodo per superare questo limite per TCR esistenti sfruttando catena di centralità. E 'stato riportato che un TCR hemichain potrebbe svolgere un ruolo più dominante in riconoscimento del target dell'antigene 2, qui chiamato centralità. analisi strutturali cristallo hanno dimostrato che uno centrichemichain di un TCR potrebbe spiegare la maggioranza della impronta sulla MHC / peptide complesso 3,4. Usando questo concetto, abbiamo precedentemente dimostrato che l'SIG35α TCRα può accoppiare con un repertorio vario di catene TCRβ e mantenere la reattività contro il peptide MART1 27-35 presentato da HLA-A2 5. Risultati simili sono stati ottenuti con l'TAK1 TCR, dove il centric TCRβ hemichain accoppiato con varie catene TCRα e mantenuto reattività per il peptide WT1 235-243 presentati da HLA-A24 6. Sia MART1 e WT1 sono antigeni associati al tumore. Catena-Centricity è stato applicato anche per studiare il riconoscimento dell'antigene di TCR invarianti CD1d-ristrette natural killer (iNKT), accoppiando la catena invariante Vα24-Jα18 (Vα24i) TCRα di TCR iNKT umani con diverse catene Vβ11 TCRβ 7.

In tutti i casi, siamo stati in grado di generare un repertorio de novo di TCR da transdurre il centrica TCR hemichain alle cellule T del sangue periferico, dove il hemichain introdotto accoppiato con il TCRα endogena o TCRβ contro-catene. In sostanza, il hemichain centric serve come esca che può essere utilizzato per identificare le opportune contromisure catene, che quando accoppiati insieme formano TCR che mantengono la specificità antigene di interesse, ma variano in affinità. Da questi nuovi repertori, siamo stati in grado di isolare TCR clonotypic con resistenza migliorata interazione contro l'antigene bersaglio rispetto al TCR preesistenti. Pertanto, riteniamo che questo metodo accelererà la pipeline di identificare TCR ottimali per l'applicazione clinica.

Protocol

1. Preparazione retrovirale Construct Codifica TCR Hemichain di interesse Linearizzare PMX vettoriale per consentire l'inserimento di un gene TCR nei passaggi successivi. Digerire il DNA plasmide con EcoRI e NotI enzimi di restrizione a 37 ° C per 3 ore (Tabella 1) 8. Effettuare elettroforesi del plasmide digerito su 1,2% gel di agarosio. Banda accise di circa 4.500 paia di basi (bps), ed eluire in 30 ml di acqua sterile utilizzando disponibili in commercio kit di es…

Representative Results

Senza la conoscenza preventiva di cui hemichain è a catena-centrica, la catena TCRα e TCRβ dovrebbe essere clonato e trasduzione di cellule T del sangue periferico, che è stato fatto nel caso di HLA-A24 / WT1 reattiva TAK1 TCR (Figura 1) separatamente. La trasduzione di TAK1β prodotto una frequenza notevolmente più elevata di cellule T antigene-specifiche. Al contrario, la trasduzione di un hemichain non-centric non voleva cedere de novo cellule multimero …

Discussion

Il primo requisito per l'applicazione di successo di questo metodo sta ottenendo sufficiente efficienza di trasduzione delle cellule T primarie con il hemichain di interesse. Nella nostra esperienza, la combinazione di utilizzare PG13 come linea cellulare di packaging e PMX come risultati vettore retrovirale in espressione stabile ed efficiente del gene introdotto nelle cellule T primarie umane. cellule packaging PG13 possono essere unicellulare clonato per selezionare le celle per imballaggio alto titolo per miglio…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by NIH grant R01 CA148673 (NH); the Ontario Institute for Cancer Research Clinical Investigator Award IA-039 (NH); BioCanRX Catalyst Grant (NH); The Princess Margaret Cancer Foundation (MOB, NH); Canadian Institutes of Health Research Canada Graduate Scholarship (TG); Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Postgraduate Scholarship (TG); Province of Ontario (TG, MA); and Guglietti Fellowship Award (TO). HLA and CD1d monomers were kindly provided by the NIH tetramer core facility.

Materials

0.05% Trypsin-EDTA Wisent Bioproducts 325-043-CL
293GPG cells Generated by Ory et al. (ref 8)
Agar Wisent Bioproducts 800-010-CG
Agarose Wisent Bioproducts 800-015-CG
Ampicillin sodium salt Wisent Bioproducts 400-110-IG
Chloroform BioShop CCL402
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix New England Biolabs N0447L
DMEM, high glucose, pyruvate Life Technologies 11995065
EcoRI New England Biolabs R0101S
EZ-10 Spin Column DNA Gel Extraction Kit BS353
Fetal Bovine Serum Life Technologies 12483020
Ficoll-Paque Plus GE Healthcare 17-1440-02
Filter Corning 431220 0.45 mm pore SFCA membrane
FITC-conjugated anti-human CD271 (NGFR) mAb Biolegend 345104 clone ME20.4
FITC-conjugated anti-human CD3 mAb Biolegend 300440 clone UCHT1
Gentamicin Life Technologies 15750078
Gibson Assembly Master Mix New England Biolabs E2611L used for multi-piece DNA assembly
HLA-A2 pentamer Proimmune depends on antigenic peptide HLA-A2/MART1 multimer used here was purchased from Proimmune
HLA/CD1d monomers NIH Tetramer Core Facility multimerize monomers according to protocol provided by NIH tetramer core facility
Human AB serum Valley Biomedical HP1022
human CD3 microbeads Miltenyi Biotec 130-050-101
IOTest Beta Mark TCR V beta Repertoire Kit Beckman Coulter IM3497
Jurkat 76 cells Generated by Heemskerk et al. (ref 10)
LB Broth Wisent Bioproducts 800-060-LG
LS MACS column Miltenyi Biotec 130-042-401
NEB 5-alpha Competent E. coli New England Biolabs C2987I
NEBuffer 3.1 New England Biolabs B7203S used for EcoRI and NotI digestion
NotI New England Biolabs R0189S
NucleoBond Xtra Midi Macherey-Nagel 740410 used for plasmid purification
PC5-conjugated anti-human CD8 mAb Beckman Coulter B21205 clone B9.11
PG13 cells ATCC CRL-10686
Phusion HF Buffer Pack New England Biolabs B0518S
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase New England Biolabs M0530L
pMX retroviral vector Cell Biolabs RTV-010
polybrene Sigma-Aldrich H-9268
Proleukin (recombinant human interleukin-2) Novartis by Rx only equivalent product can be purchased from Sigma-Aldrich
Purified anti-human CD3 antibody Biolegend 317301 clone OKT3, used for T cell stimulation
RPMI 1640 Life Technologies 11875119
SA-PE Life Technologies S866 used for multimerizing monomers from NIH tetramer core facility
SMARTer RACE 5'/3'  Kit Clontech 634858
Sterile water Wisent Bioproducts 809-115-LL
SuperScript III First-Strand Synthesis System Invitrogen 18080051 for cDNA synthesis
Syringe BD 301604 10 mL, slip tip
Tetracycline hydrochloride Sigma-Aldrich T7660
TransIT-293 Mirus Bio MIR 2700 used to transfect 293GPG cells
TRIzol Reagent Life Technologies 15596026

Referencias

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Citar este artículo
Guo, T., Ochi, T., Nakatsugawa, M., Kagoya, Y., Anczurowski, M., Wang, C., Rahman, M. A., Saso, K., Butler, M. O., Hirano, N. Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain. J. Vis. Exp. (116), e54697, doi:10.3791/54697 (2016).

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