उत्पादक<em> डी नोवो</em> सेंट्रिक Hemichain की रेट्रोवायरल पारगमन द्वारा विशिष्ट प्रतिजन मानव टी सेल रिसेप्टर्स
Summary
इस के साथ साथ हम विशिष्ट प्रतिजन टी सेल रिसेप्टर्स (TCRs), TCRα या एक मौजूदा TCR की TCRβ बाँधना ब्याज की प्रतिजन विशिष्टता रखने, परिधीय टी सेल रिसेप्टर प्रदर्शनों की सूची के पूरक hemichain साथ द्वारा उत्पन्न करने के लिए एक उपन्यास विधि का वर्णन है। नए सिरे से उत्पन्न TCRs आत्मीयता के साथ अलग प्रतिजन विशिष्टता बरकरार रहती है।
Abstract
टी सेल रिसेप्टर्स (TCRs) टी कोशिकाओं की विशिष्टता को निर्देशित करने के लिए प्रतिरक्षा का एक होनहार साधन के रूप में ट्यूमर को लक्षित करने के चिकित्सकीय इस्तेमाल कर रहे हैं। इसलिए, विभिन्न ट्यूमर जुड़े एंटीजन के लिए विशिष्ट क्लोनिंग TCRs कई अध्ययनों का लक्ष्य दिया गया है। एक प्रभावी टी सेल प्रतिक्रिया प्रकाश में लाना, TCR इष्टतम आत्मीयता के साथ लक्ष्य प्रतिजन समझना चाहिए। हालांकि, इस तरह के क्लोनिंग TCRs एक चुनौती है और कई उपलब्ध TCRs किया गया है आत्मीय प्रतिजन के लिए उप इष्टतम आत्मीयता के पास है। इस प्रोटोकॉल में, हम नए सिरे से उच्च आत्मीयता विशिष्ट प्रतिजन hemichain केन्द्रित शोषण से मौजूदा TCRs का उपयोग कर TCRs क्लोनिंग की विधि का वर्णन है। यह ज्ञात है कि कुछ TCRs के लिए, प्रत्येक TCRα या TCRβ hemichain प्रतिजन मान्यता के लिए भी उतना ही योगदान नहीं है, और प्रमुख hemichain केंद्रित hemichain के रूप में जाना जाता है। हमें पता चला है कि मूल जवाबी श्रृंखला से अलग काउंटर-चेन के साथ केंद्रित hemichain बाँधना द्वारा, हम प्रतिजन रों बनाए रखने में सक्षम हैंpecificity, आत्मीय प्रतिजन के लिए अपनी बातचीत ताकत नियमन है। इस प्रकार, एक दिया TCR की चिकित्सीय क्षमता केंद्रित और काउंटर hemichains के बीच बाँधना अनुकूलन के द्वारा सुधार किया जा सकता है।
Introduction
टी सेल रिसेप्टर्स (TCRs) heterodimeric अनुकूली प्रतिरक्षा टी lymphocytes द्वारा व्यक्त रिसेप्टर्स, एक TCRα और TCRβ श्रृंखला से बना रहे हैं। वे वी (डी) जे जीन क्षेत्रों, जो एक अत्यंत विविध एचएलए / पेप्टाइड परिसरों के लगभग असीमित विन्यास को पहचानने में सक्षम प्रदर्शनों की सूची का उत्पादन का दैहिक पुनर्व्यवस्था के माध्यम से उत्पन्न कर रहे हैं। चिकित्सकीय, टी कोशिकाओं ट्यूमर जुड़े एंटीजन के लिए clonotypic TCRs विशिष्ट व्यक्त करने के लिए इंजीनियर के कैंसर 1 की एक किस्म में प्रभावकारिता का प्रदर्शन किया है। हालांकि, कई TCRs इस उद्देश्य के लिए क्लोन ब्याज की प्रतिजन, जो उनके चिकित्सीय आवेदन सीमा के लिए पर्याप्त समानता की कमी है।
यहाँ, हम श्रृंखला केन्द्रित शोषण से मौजूदा TCRs के लिए इस सीमा को पार करने के लिए एक विधि का वर्णन। यह बताया गया है कि एक TCR hemichain लक्ष्य प्रतिजन 2 की मान्यता में एक अधिक प्रभावी भूमिका निभा सकता है, यहाँ केन्द्रित करार दिया। क्रिस्टल संरचनात्मक विश्लेषण है कि एक केंद्रित से पता चला हैएक TCR की hemichain एमएचसी / पेप्टाइड जटिल 3,4 पर पदचिह्न के बहुमत के लिए खाते सकता है। इस अवधारणा का उपयोग करना, हम पहले से दिखा दिया है कि SIG35α TCRα TCRβ चेन की एक विविध प्रदर्शनों की सूची के साथ जोड़ी और एचएलए-A2 5 द्वारा प्रस्तुत MART1 27-35 पेप्टाइड के खिलाफ जेट बनाए रख सकते हैं। इसी तरह के परिणाम TAK1 TCR, जहां केंद्रित TCRβ hemichain विभिन्न TCRα चेन के साथ रखा और एचएलए-A24 6 द्वारा प्रस्तुत WT1 235-243 पेप्टाइड के लिए जेट बनाए रखा के साथ प्राप्त किया गया। दोनों MART1 और WT1 ट्यूमर जुड़े एंटीजन होते हैं। चेन केन्द्रित भी CD1d-प्रतिबंधित अपरिवर्तनीय प्राकृतिक हत्यारा (iNKT) TCRs के प्रतिजन मान्यता अध्ययन करने के लिए अलग अलग Vβ11 TCRβ चेन 7 के साथ मानव iNKT TCRs के अपरिवर्तनीय Vα24-Jα18 (Vα24i) TCRα श्रृंखला बाँधना द्वारा लागू किया गया था।
सभी मामलों में, हम ट्रांस द्वारा TCRs के एक नए सिरे से प्रदर्शनों की सूची उत्पन्न करने में सक्षम थेपरिधीय रक्त टी कोशिकाओं, जहां शुरू की hemichain अंतर्जात TCRα या TCRβ जवाबी चेन के साथ रखा करने के लिए केंद्रित TCR hemichain ducing। संक्षेप में, केंद्रित hemichain एक चारा है कि उचित जवाबी चेन, जो जब एक साथ रखा TCRs है कि ब्याज की प्रतिजन विशिष्टता बनाए रखने के लिए फार्म, फिर भी आत्मीयता में बदलती पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के रूप में कार्य करता है। इन उपन्यास repertoires से, हम लक्ष्य प्रतिजन पूर्व मौजूदा TCRs की तुलना के खिलाफ सुधार बातचीत ताकत के साथ clonotypic TCRs को अलग-थलग करने में सक्षम थे। इसलिए, हमें विश्वास है कि इस विधि के नैदानिक आवेदन के लिए इष्टतम TCRs की पहचान की पाइप लाइन को गति देगा।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस विधि के सफल आवेदन के लिए पहली आवश्यकता ब्याज की hemichain के साथ प्राथमिक टी कोशिकाओं की पर्याप्त पारगमन दक्षता प्राप्त है। हमारे अनुभव, PG13 पैकेजिंग सेल लाइन और PMX मानव प्राथमिक टी कोशिकाओं में शुरू की जीन ?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIH grant R01 CA148673 (NH); the Ontario Institute for Cancer Research Clinical Investigator Award IA-039 (NH); BioCanRX Catalyst Grant (NH); The Princess Margaret Cancer Foundation (MOB, NH); Canadian Institutes of Health Research Canada Graduate Scholarship (TG); Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Postgraduate Scholarship (TG); Province of Ontario (TG, MA); and Guglietti Fellowship Award (TO). HLA and CD1d monomers were kindly provided by the NIH tetramer core facility.
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA | Wisent Bioproducts | 325-043-CL | |
| 293GPG cells | Generated by Ory et al. (ref 8) | ||
| Agar | Wisent Bioproducts | 800-010-CG | |
| Agarose | Wisent Bioproducts | 800-015-CG | |
| Ampicillin sodium salt | Wisent Bioproducts | 400-110-IG | |
| Chloroform | BioShop | CCL402 | |
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix | New England Biolabs | N0447L | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Life Technologies | 11995065 | |
| EcoRI | New England Biolabs | R0101S | |
| EZ-10 Spin Column DNA Gel Extraction Kit | BS353 | ||
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 12483020 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Filter | Corning | 431220 | 0.45 mm pore SFCA membrane |
| FITC-conjugated anti-human CD271 (NGFR) mAb | Biolegend | 345104 | clone ME20.4 |
| FITC-conjugated anti-human CD3 mAb | Biolegend | 300440 | clone UCHT1 |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750078 | |
| Gibson Assembly Master Mix | New England Biolabs | E2611L | used for multi-piece DNA assembly |
| HLA-A2 pentamer | Proimmune | depends on antigenic peptide | HLA-A2/MART1 multimer used here was purchased from Proimmune |
| HLA/CD1d monomers | NIH Tetramer Core Facility | multimerize monomers according to protocol provided by NIH tetramer core facility | |
| Human AB serum | Valley Biomedical | HP1022 | |
| human CD3 microbeads | Miltenyi Biotec | 130-050-101 | |
| IOTest Beta Mark TCR V beta Repertoire Kit | Beckman Coulter | IM3497 | |
| Jurkat 76 cells | Generated by Heemskerk et al. (ref 10) | ||
| LB Broth | Wisent Bioproducts | 800-060-LG | |
| LS MACS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| NEB 5-alpha Competent E. coli | New England Biolabs | C2987I | |
| NEBuffer 3.1 | New England Biolabs | B7203S | used for EcoRI and NotI digestion |
| NotI | New England Biolabs | R0189S | |
| NucleoBond Xtra Midi | Macherey-Nagel | 740410 | used for plasmid purification |
| PC5-conjugated anti-human CD8 mAb | Beckman Coulter | B21205 | clone B9.11 |
| PG13 cells | ATCC | CRL-10686 | |
| Phusion HF Buffer Pack | New England Biolabs | B0518S | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530L | |
| pMX retroviral vector | Cell Biolabs | RTV-010 | |
| polybrene | Sigma-Aldrich | H-9268 | |
| Proleukin (recombinant human interleukin-2) | Novartis | by Rx only | equivalent product can be purchased from Sigma-Aldrich |
| Purified anti-human CD3 antibody | Biolegend | 317301 | clone OKT3, used for T cell stimulation |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 11875119 | |
| SA-PE | Life Technologies | S866 | used for multimerizing monomers from NIH tetramer core facility |
| SMARTer RACE 5'/3' Kit | Clontech | 634858 | |
| Sterile water | Wisent Bioproducts | 809-115-LL | |
| SuperScript III First-Strand Synthesis System | Invitrogen | 18080051 | for cDNA synthesis |
| Syringe | BD | 301604 | 10 mL, slip tip |
| Tetracycline hydrochloride | Sigma-Aldrich | T7660 | |
| TransIT-293 | Mirus Bio | MIR 2700 | used to transfect 293GPG cells |
| TRIzol Reagent | Life Technologies | 15596026 |
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