En effektiv og enkel metode til computerbaseret analyse af nematode svømning adfærd i flydende beskrives. Metoden kræver lidt at ingen investering for C. elegans laboratorier. Den hardware, der anvendes er standard, og computeren software til adfærdsanalyse (Celest) er en open source én.
Dissekere de neuronale og neuromuskulære kredsløb, der regulerer adfærd er fortsat en stor udfordring i biologi. Den rundorm Caenorhabditis elegans har vist sig at være en uvurderlig model organisme i at hjælpe til at tackle denne udfordring, fra inspirerende teknologiske tilgange, bygge den menneskelige hjerne connectome, til rent faktisk at kaste lys over de specifikke molekylære førere af basale funktionelle mønstre. Hovedparten af de adfærdsmæssige studier i C. elegans er blevet udført på faste substrater. I væske, dyr udviser adfærdsmønstre, der omfatter bevægelse på en afstand af hastigheder i 3D, samt delvise kropsbevægelser, såsom en posterior krølle uden forreste formændring, som introducerer nye udfordringer for kvantificering. Trinnene en enkel procedure og anvendelse af en software, som muliggør høj opløsning analyse af C. elegans svømme adfærd, præsenteres her. Den software, opkaldt Celest, bruger en specialiseret computerprogram, der sporerflere dyr samtidigt og giver nye foranstaltninger af C. elegans bevægelse i væske (svømning). Foranstaltningerne er for det meste funderet i dyr kropsholdning og er baseret på matematik, der anvendes i computer vision og mønstergenkendelse, uden beregningsmæssige krav til tærskel cut-offs. Den software værktøj kan bruges til både at vurdere den samlede svømning dygtighed i hundredvis af dyr fra kombineret forsøg lille batch og til at afsløre nye fænotyper selv i godt karakteriserede genetiske mutanter. Udarbejdelsen af prøver til analyse med Celest er enkel og low-tech, så bred tilpasning af det videnskabelige samfund. Anvendelse af den beregningsmæssige tilgang beskrevet her, bør derfor bidrage til større forståelse for adfærd og adfærdsmæssige kredsløb i C. elegans model.
Definition hvordan genetik, epigenetik, erfaring og miljø påvirker adfærd er en stor udfordring i moderne biologi. Enkel, genetisk medgørlige modeller, der kan beregningsmæssigt spores og måles kan lave kritiske bidrag mod dette mål. De nematode Caenorhabditis elegans er en sådan model. Formålet med denne artikel er at demonstrere, hvordan C. elegans svømning bevægelse kan spores og kvantificeret til at udtrække oplysninger om otte nye funktioner med biologisk relevans.
C. elegans har en forholdsvis kort levetid på omkring 2 – 3 i w og en reproduktiv periode på ca. 4 d ved 20 ° C 1,2. I standard laboratorie kulturer, er denne mikroskopiske rundorm dyrket på Petri plader indeholdende nematodevækst Media (NGM), der er spredt med en bakteriel fødekilde 3,4. WT N2 dyr bevæger sig aktivt i elegante sinusformede bølger på agar-fyldte plader; de ændrer bevægelse rottees ved roaming (mad søger), bolig (browsing), eller hos et måltid (inaktiv mæthed ubevægelighed) 5. Leverfunktion 6 eller alder 7-12 kan også dramatisk ændre bevægelse på plader.
Gener, der modulerer adfærd, healthspan eller ældning, kan funktionelt karakteriseret ved analyse C. elegans bevægelsesmønstre eller bevægelse. En metode til at måle healthspan er at klassificere aldrende voksne i tre kategorier (f.eks, A, B, og C) i henhold til deres bevægelse på plader, med kraftig fysisk aktivitet være klasse A og lammelse er klasse C 7,8,13. Selv om en sådan kvalitativ sortering er nyttigt at afsløre forskelle i fysisk kondition, kategorierne er brede uden klare grænser og dermed deres scoring er underlagt Experimenter bias.
Et stigende antal trackere har forhøjet objektivitet, raffinement og præcision af analysen af C. elegans bevægelsepå faste medier 14-18. C. elegans bevægelse på plader er for det meste begrænset til det plan, hvori dyret kommer i kontakt med den faste overflade af mediet. (C. elegans kan også inducere udforskning ved at løfte hovedet væk fra resten af kroppen, der stadig er i kontakt med en fast overflade, positionere kroppen i flere planer. Men denne adfærd er usædvanligt.) Når de anbringes i flydende, dette nematode indleder en bølgeformet bevægelse, eller svømning, der indeholder mere omfattende dimensionel bevægelse, en større vifte af hastighed og dybde af bevægelse, og en øget forekomst med alderen af forreste bevæger anderledes end posterior i forhold til dyr på faste overflader. Som en hurtig analyse af fysisk kondition og reaktion på nye omgivelser, kan en eksperimentator placere et individuelt dyr i en flydende drop og score dens frekvens af kroppens bøjninger under dissekere rækkevidde. Videooptagelse kan lette nuværende og fremtidige scoringer af svømning styrken idyr. Men den manuelle fremgangsmåde begrænser antallet af funktioner, der kan blive noteret, og er fuldt tvunget til at lave et dyr ad gangen.
Locomotion i væsken er blevet mindre udforsket end bevægelse på faste medier. Der er faktisk nogle software muligheder, der er robust og let at implementere i laboratoriet for at måle bevægelse i flydende 19-24. Den software Celest (C. elegans Swim Test) tilbyder nemme at anvende og matematiske-baserede foranstaltninger, der leverer data (krumning scores) direkte relevante for arten af bevægelsen 8; (detaljeret beskrivelse af egenskaber og fordele i Restif et al. 8). Desuden beregningsanalyse muliggør belysning af fænotypiske egenskaber, der er umuligt for det menneskelige øje at score. Her bliver data, der eksemplificerer løsningen af denne analyse tilgang præsenteres og en let at implementere protokollen til at optage svømme forsøg for beskrives efterfølgende Celest analyse.
Brugen af C. elegans som modelsystem fortsætter med at stige på grund af sin genetiske formbarhed, eksperimenterende sporbarhed og anatomi kommenteret på minutiøse detaljer. For eksempel er den neuronale struktur og tilslutning af C. elegans hermafrodit klart udstukket 34-36, i høj grad lette undersøgelser af specifikke neuronale kredsløb, der styrer bestemte adfærd. 302 neuroner udgør den voksne hermafrodit nervesystem, hvilken proces en bred vifte af sensoriske input i basale adfærdsmæssige udgange som bevægelse. Strukturen af den mere komplekse mandlige nervesystem er også blevet beskrevet 37, således kønsbestemt kredsløb, der skal behandles. 37
C. elegans adfærd er blevet grundigt undersøgt på standard dyrkningsplader indeholdende faste medier. Da WT C. elegans bevæger sig i forudsigelige sinusformede bølger på agar-fyldte plader, afvigelser fra denoverordnede mønster kan påvises ved øjet og afsluttet manuelt. Denne fremgangsmåde er imidlertid underlagt eksperimentatorens kriterium og er arbejdskrævende. Hardware og software, der er designet til at spore og måle C. elegans bevægelse på faste medier fjerne subjektivitet bias og give mulighed for større studier, tillader mere avancerede biologiske spørgsmål, der skal behandles. Den seneste adfærdsmæssige database oprettet af Schafer lab 16 er et glimrende eksempel på den analytiske udvidelse og dybde, som er opnået med et beregningsmæssige system, til brug på plader.
Når WT C. elegans er placeret i flydende, dyret hurtigt tilpasser sin bevægelse til det nye miljø, indlede en svømmetur. C. elegans svømning anvender en større vifte af bevægelse end at kravle og kan være mere uregelmæssig 8. Software som Celest skal udfylde hullet for detaljeret analyse af C. elegans adfærd i væske, Permirg ø ring kvantificering af motion-associerede parametre, der ikke umiddelbart måles af un-aided øje, eller som kan opnås hurtigere end manuel scoring. I otte hårde h en borger kan behandle op til 200 videoer, ~ 1.000 poster dagligt.
Softwaren definerer svømning vurdering parametre, der tjener som en omfattende fingeraftryk af fysisk kondition og adfærd. Udover at berige forståelsen af de komplekse facetter af C. elegans adfærd i flydende og deres underliggende molekylære veje, kan denne software kan bruges til at udforske flere aspekter af biologi, herunder farmakologiske reaktioner, aldring og tydelig adfærd. Præsenteret her, den oversigt over de kvantificerede forandringer, der sker i den fysiske udførelse af C. elegans voksne, som de alder er et eksempel på en sådan anvendelse af softwaren (for en mere detaljeret redegørelse, se Restif et al. 8). I forbindelse med aldring, nogle målte parametre faldt mensandre steget eller ikke konsekvent ændre sig i vildtype. Trends blev bekræftet i høj grad af den beregningsmæssige profil levetid mutanter, og de relative profiler af yndefulde og dårlige ager kohorter af samme aldersgrupper holdes i ensartede miljøforhold. Den høje opløsning af softwaren kan også afsløre subtile fænotyper hidtil ukendt i grundigt karakteriseret mutanter (f.eks alder-1 (hx546) i figur 1).
Der er et par særligt kritiske trin i protokollen beskrevet. Fastholdelse af en konstant temperatur miljø mellem svømme miljø og stammen plade kultur er vigtig for svømme reproducerbarhed, så eksperimentatorer er stærkt tilskyndet til at gå til store smerter at undgå tilfældige temperaturændringer. Swim medier bør være på samme temperatur som pladerne. Ligeledes vil meget opmærksom på drop størrelse for svømme med til at sikre reproducerbarhed. Endelig er det klogt at tænke iforhånd om losning af de store videofiler, der ophobes. anbefales Behandling billeder på et websted bortset fra videooptagelse computer.
Brugen af softwaren præsenteres her for svømme analyse har visse begrænsninger. Først, selvom programmerne samtidigt kan spore flere dyr, hvis mere end fem dyr i fællesskab analyseres, der er en øget risiko for, at dyrene vil svømme over hinanden i videobillederne. Når programmet kan ikke entydigt bestemme hvilket dyr var der, det censurerer disse data frames. Selv om dette program funktion sikrer, at data for de enkelte dyr er af høj kvalitet, det begrænser gennemløb. For det andet bør billederne være temmelig ren, der er fri for støv, snavs og genskin fra lys, som tilhørende signaler også kan forvirre billedet analyse. Som nævnt i protokol afsnit 2.1.1, en meget low-tech investering, der i høj grad kan hjælpe billedoptagelse ved at eliminere komplikationer med udsving in miljømæssige belysning er at dække området fase med en mørk klud, der ikke tillader omgivende lys at nå scenen. For det tredje program optimeret til dyr på voksne stadium. Unge larver svømmer meget hurtigt og har små organer, hvilket øger program fejl. For det fjerde nogle af softwaren udnytter MATLAB, og når der er versionsopgraderinger og / eller operativsystem opgraderinger, kan nogle programmer links blive afbrudt. I øjeblikket er den software, der er optimeret til brug på MATLAB 2015b og Mac OS-version 10.10, men vi forventer snart at skrive en software version, der er mere robust over for sådanne ændringer. Endelig kan video datafiler blive store hurtigt, og kræver lagerplads skal tildeles.
Sammenfattende præsenteres her er en enkel metode, som let kan implementeres af alle laboratorier uden meget investeringer for at skabe videoer af C. elegans svømning for Celest analyse. Funktioner af softwarepakken omfatter omfattende automatisering fra sporing gennemanalyse, simultan multi-animalsk sporing, og anvendelse af matematiske baser (dvs. krumning foranstaltninger) til kvantificering af de fleste bevægelseskomponenter parametre. Softwaren er open source, med kode og demoer offentligt tilgængeligt som nærmere beskrevet i Restif et al. 8. Selv om programmet har avanceret computer vision analyse for sporing, andre offentliggjorte sporingssystemer (f.eks Greenblum et al., 2014 38) er kompatible med parameteren analyse af softwaren præsenteres her. Fremtidige forbedringer vil være rettet mod at omdanne software i en mere robust pakke, der ikke begrænser brugen af de særlige versioner af de ovennævnte operativsystemer (også angivet i tabellen Materialer).
The authors have nothing to disclose.
Celest udvikling blev støttet af NIH tilskud R21AG027513 og U01AG045864. Data og nogle korte video repræsentationer er tilpasset fra Restif et al. (2014) 8, som blev udgivet under Creative Commons Attribution (CC BY) licens http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. Vi takker Ricardo Laranjeiro for manuskriptet hjælp.
REAGENT | |||
N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | C. elegans wild type (ancestral). | |
OP50 Escherichia coli | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Biosafety Level: BSL-1. | |
OP50-1 Escherichia Coli | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Streptomycin resistant strain of OP50. Biosafety Level: BSL-1. | |
Streptomycin sulfate salt | Sigma-Aldrich | S6501 | |
Printed Microscope Slides | Thermo Fisher Scientific | Gold Seal Fluorescent Antibody Microslides: 3032-002 | have two etched 10mm diameter circles delineated by white ceramic ink |
Nematode Growth Medium (NGM) | For 1L: 17g Agar, 3g NaCl, 2.5g Peptone, 1mL 1M CaCl2, 1mL 5mg/mL Cholesterol in ethanol, 25mL 1M KPO4 buffer, 1mL 1M MgSO4, H2O to 1 L. Sterilize by autoclaving. | Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook, 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1 (2006) | |
M9 buffer | For 1L: 3g KH2PO4, 6g Na2HPO4, 5g NaCl, 1mL 1 M MgSO4, H2O to 1 L. Sterilize by autoclaving. | Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook, 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1 (2006) | |
EQUIPMENT | |||
CeleST | Driscoll Lab, Rutgers University | C. elegans Swim Test | Open Source, see http://celestmod.github.io/CeleST/ and http://celest.mbb.rutgers.edu/ |
MATLAB | www.mathworks.com/downloads | MatLab version 2015b (best) | The CeleST version demonstrated here has best functionality with Mac OS 10.10 and MatLab 2015b. MATLAB 2015B introduced changes to how MATLAB handled graphics, including a new coding convention and syntax. These changes resolved an issue that couldn't be resolved elegantly (primarily because the internals of MATLAB really needed the major graphics overhaul implemented in MATLAB 2015B). For this reason, CeleST should always be run on MATLAB 2015B or later versions. However for users without access to MATLAB version 2015B or later (or MATLAB at all), we have created a CeleST program that doesn't need MATLAB on the computer at al. An installer is downloaded by the prospective user and then it installs itself onto the computer through a couple prompts like most programs. |
Mac OS | www.apple.com | Version 10.10 | Currently, CeleST has been ported to the major operating systems (Windows, Mac, and Linux). The current code can be run on any of the operating systems and there are versions for each operating system that don't even require users to have MATLAB to use CeleST (this version requires a large download). The Windows version has been tested the least and is most prone to bugs as such. Linux has been moderately tested. And Mac has been and continues to be tested extensively (primarily because it's the operating system in our lab). |
Stereomicroscope | Zeiss | Stemi 2000-C | |
Transmitted Light Base | Diagnostic Instruments | TLB 3.1 | |
Digital CCD Camera | QImaging | Rolera-XR Mono Fast 1394 (ROL-XR-F-M-12) | |
Digital Video Recording Software | Norpix | Streampix Version 3.17.2 |