En effektiv og enkel metode for databasert analyse av nematode svømming oppførsel i flytende er beskrevet. Metoden krever lite eller ingen investering for C. elegans laboratorier. Maskinvaren som brukes er standard, og dataprogrammer for atferdsanalyse (Celest) er en åpen kildekode ett.
Dissekere de nevrale og nevromuskulære kretser som regulerer atferd er fortsatt en stor utfordring i biologi. Den nematode Caenorhabditis elegans har vist seg å være en uvurderlig modellorganisme i å hjelpe til å takle denne utfordringen, fra inspirerende teknologiske tilnærminger, og bygge den menneskelige hjerne connectome, å faktisk belyse de spesifikke molekylære driverne av grunnleggende funksjonelle mønstre. Hovedtyngden av de atferdsmessige studier i C. elegans har blitt utført på faste underlag. I flytende, dyr utviser atferdsmønstre som inkluderer bevegelse i en rekke hastigheter i 3D, samt delvis kroppsbevegelser, for eksempel en posterior krøller uten anterior form for bevegelse, som introduserer nye utfordringer for kvantifisering. Trinnene i en enkel prosedyre, og bruk av en programvare som gir høy oppløsning analyse av C. elegans svømme atferd, blir presentert her. Programvaren, oppkalt Celest, bruker en spesialisert dataprogram som sporerflere dyr samtidig og gir nye tiltak av C. elegans bevegelse i væske (svømming). Tiltakene er hovedsakelig forankret i dyre holdning og basert på matematikk som brukes i maskinen visjon og mønstergjenkjenning, uten beregnings krav til terskel cut-offs. Programvaren verktøyet kan brukes til både å vurdere samlet svømming prowess i hundrevis av dyr fra kombin liten batch forsøk og for å avsløre nye fenotyper selv i godt karakterisert genetiske mutanter. Utarbeidelse av prøver for analyse med Celest er enkel og low-tech, slik bred tilrettelegging av det vitenskapelige samfunn. Bruk av beregnings tilnærmingen som er beskrevet her bør derfor bidra til større forståelse av atferd og atferds kretser i C. elegans modell.
Definere hvordan genetikk, epigenetikk, erfaring og miljø påvirker atferd er en stor utfordring i moderne biologi. Enkle, genetisk mottagelig modeller som kan beregnings spores og målte kan ta viktige bidrag mot dette målet. De nematode Caenorhabditis elegans er en slik modell. Hensikten med denne artikkelen er å vise hvordan C. elegans svømming bevegelse kan spores og kvantifisert å hente ut informasjon om åtte nye funksjoner med biologisk relevans.
C. elegans har en forholdsvis kort levetid på ca 2 – 3 m og en reproduksjons periode på omtrent 4 d ved 20 ° C 1,2. I standard laboratorie kulturer, er dette mikroskopisk nematode dyrket på Petri plater som inneholder nematode Vekst Media (NGM) som er spredt med en bakteriell matkilde 3,4. WT N2 dyr bevege aktivt i elegante sinusbølger på agar-fylt plater; de endrer bevegelse rottees ved roaming (mat seeking), bolig (surfing), eller komme seg etter et måltid (inaktiv metthet quiescence) 5. Nedskrivning 6 eller alderen 7-12 kan også dramatisk endre bevegelse på tallerkener.
Gener som modulerer atferd, healthspan eller aldring, kan være funksjonelt preget av å analysere C. elegans bevegelsesmønstre eller bevegelse. En måte å måle healthspan er å klassifisere aldrende voksne inn i tre kategorier (f.eks, A, B og C) i henhold til deres bevegelse på platene, med sterk fysisk aktivitet som klasse A og lammelse blir klasse C 7,8,13. Selv om en slik kvalitativ sortering er nyttig for å avdekke forskjeller i fysisk form, kategoriene er bred uten klare grenser og dermed deres scoring er gjenstand for forskningsforventninger.
Et økende antall trackere har forhøyede objektivitet, raffinement, og presisjonen i analysen av C. elegans bevegelsepå faste medier 14-18. C. elegans bevegelse på platene er stort sett begrenset til det plan i hvilket dyret kommer i kontakt med den faste overflate av mediet. (C. elegans kan også indusere utforskning ved å løfte hodet vekk fra resten av kroppen som fortsatt er i kontakt med en fast overflate, plassering av legemet i flere plan. Dette er imidlertid uvanlig dette problemet.) Når det plasseres i væske, denne nematode initierer en undulatory bevegelse, eller svømming, som har mer omfattende dimensjonal bevegelse, et større spekter av fart og dybde av bevegelse, og en økt forekomst med alderen av fremre flytte forskjellig fra bakre forhold til dyr på faste overflater. Som en rask analyse av fysisk form og respons på nytt miljø, kan en eksperimentator plassere en enkelt dyr i en væske dråpe og scorer sitt hyppigheten av kroppen svinger under dissekere omfang. Videoopptak kan lette nåværende og fremtidige scorings over svømme kraft avdyr. Men den manuelle tilnærmingen begrenser antall funksjoner som kan skåres, og er fullt begrenset til scoring ett dyr om gangen.
Locomotion i væske er mindre utforsket enn locomotion på faste medier. Faktisk er det få programvare alternativer som er robuste og enkle å gjennomføre i laboratoriet for å måle bevegelse i væske 19-24. Programvaren Celest (C. elegans Swim Test) tilbyr enkelhet i bruk og matematiske baserte tiltak som leverer data (kurvatur scores) direkte relevant for innholdet i bevegelse 8; (detaljert beskrivelse av funksjoner og fordeler i Restif et al. 8). Videre gjør beregnings analyse klarlegging av fenotypiske egenskaper som er umulig for det menneskelige øyet å score. Her er data som eksemplifiserer oppløsningen av denne analysen tilnærming presentert og en enkel å implementere protokollen til å ta opp svømme prøvelser for påfølgende Celest analyse er beskrevet.
Bruken av C. elegans som modellsystem fortsetter å øke på grunn av sin genetiske malleability, eksperimentell tractability og anatomi kommenterte til nitid detalj. For eksempel er neuronal struktur og tilkobling av C. elegans hermafroditt klart kartlagt 34-36, i stor grad legge til rette for undersøkelser av spesifikke nevronale kretser som styrer spesielle atferd. 302 nevroner utgjør voksen hermafroditt nervesystem, som behandler et bredt spekter av sanseinntrykk i grunnleggende atferds utganger som bevegelse. Strukturen av de mer komplekse hann nervesystemet er også blitt beskrevet 37, slik at kjønnsspesifikke krets som skal behandles. 37
C. elegans atferd har blitt grundig studert på standard kultur plater som inneholder faste medier. Siden WT C. elegans beveger seg i forutsigbare sinusbølger på agar-fylt plater, avvik fragenerelle mønsteret kan oppdages ved øyet og scoret manuelt. Denne tilnærmingen er imidlertid underlagt eksperimentators kriterium og er arbeidskrevende. Hardware og software verktøy utviklet for å spore og måle C. elegans locomotion på faste medier fjerne subjektiviteten skjevhet og gi rom for store studier, tillater mer avanserte biologiske spørsmål tas opp. Den nylige atferds database opprettet av Schafer lab 16 er et utmerket eksempel på den analytiske forlengelse og dybde som er oppnådd med et beregningssystem for locomotion på tallerkener.
Når WT C. elegans er plassert i væsken, tilpasser dyret raskt sin bevegelse til det nye miljøet, initiere en svømmetur. C. elegans svømming utnytter et større spekter av bevegelse enn krypende og kan være mer uregelmessig 8. Programvare som Celest er ment å fylle gapet for detaljert analyse av C. elegans atferd i væske, Permitte opp kvantifisering av motion-forbundet parametere som ikke er lett målt ved un assistert øye, eller som kan oppnås raskere enn manuell scoring. I åtte vanskelig h en person kan behandle opptil 200 videoer, ~ 1000 poster per dag.
Programvaren definerer svømming vurdere parametere som fungerer som en omfattende fingeravtrykk av fysisk form og atferd. I tillegg til berikende forståelse av komplekse fasetter av C. elegans atferd i flytende og deres underliggende molekylære stier, kan denne programvaren brukes til å utforske flere aspekter av biologi, inkludert farmakologiske tiltak, aldring og distinkt oppførsel. Presentert her, oversikt over de kvantifiserte endringer som skjer i den fysiske utførelsen av C. elegans voksne som de alder er ett eksempel på en slik anvendelse av programvaren (for en nærmere redegjørelse, se Restif et al. 8). I forbindelse med aldring, enkelte målte parametre avslått mensandre økt eller ikke konsekvent endring i villtypen. Trender ble bekreftet i stor grad av beregningsorientert profil levetid mutanter, og de relative profiler av grasiøs og dårlige Ager årskull av samme alder populasjoner holdt i ensartede miljøforhold. Den høye oppløsning av programvaren kan også avsløre subtile fenotyper tidligere ukjente i stor utstrekning karakterisert mutanter (for eksempel alder-1 (hx546) i figur 1).
Det er noen spesielt kritiske trinn i protokollen beskrevet. Opprettholde en konstant temperatur miljø mellom svømme miljøet og belastningen plate kultur er viktig for svømme reproduserbarhet, så forskere er sterkt oppfordret til å gå til store anstrengelser for å unngå tilfeldige temperaturendringer. Svømme media bør være på samme temperatur som platene. Likeledes vil nøye hensyn til dråpestørrelse svømme bidra til å sikre reproduserbarhet. Til slutt, er det klokt å tenke påavansere om lossing av de store videofiler som samler. Det anbefales å behandle bilder på et nettsted bortsett fra videoopptak datamaskin.
Bruken av programvaren som presenteres her for svømmetur analyse har visse begrensninger. Første, selv om programmene samtidig kan spore flere dyr, hvis mer enn fem dyr i fellesskap analysert, er det en økt mulighet for at dyrene skal svømme over hverandre i de videobilder. Når programmet kan ikke entydig bestemme hvilke dyr var som det sensurerer de datarammer. Selv om denne program-egenskap sikrer at data for individuelle dyr som er av høy kvalitet, det begrenser gjennomstrømningen. For det andre bør bildene være ganske ren, som er fri for støv, smuss og gjenskinn fra lys, som tilhørende signaler kan også forvirre bildeanalyse. Som nevnt i protokollen avsnitt 2.1.1, en svært low-tech investering som i stor grad kan hjelpe bildeopptak ved å eliminere komplikasjoner med svingninger in miljø belysning er å dekke sceneområdet med et mørkt stoff som ikke tillater omgivende lys som kommer til scenen. For det tredje er programmet optimalisert for dyr på voksne stadiet. Unge larver svømmer veldig fort og har små kropper, noe som øker programfeil. Fjerde, noen av programvaren bruker MATLAB, og når det er versjonsoppgraderinger og / eller oppgraderinger av operativsystemet, kan enkelte program linker bli forstyrret. Foreløpig er programvare optimalisert for bruk på MATLAB 2015b og Mac OS versjon 10.10, men vi forventer snart å publisere en programvareversjon som er mer robust mot slike endringer. Endelig kan videodatafiler blir store rask, og krever lagringsplass til å bli tildelt.
I sammendraget, som presenteres her er en enkel metode som lett kan implementeres av alle laboratorier, uten mye investering for å lage videoer av C. elegans svømming for Celest analyse. Funksjoner av programvarepakken inkluderer omfattende automatisering fra sporing gjennomanalyse, samtidig med flere dyr sporing, og bruk av matematiske baser (dvs. kurvatur tiltak) for kvantifisering av de fleste locomotion parametere. Programvaren er åpen kildekode, med kode og demoer offentlig tilgjengelig som beskrevet i Restif et al. 8. Selv om programmet har avansert datamaskin visjon analyse for sporing, andre publiserte sporingssystemer (f.eks Greenblum et al., 2014 38) er kompatible med parameteren analyse av programvare som presenteres her. Fremtidige forbedringer vil være rettet mot å konvertere programvaren til en mer robust pakke som ikke begrenser bruken til de spesifikke versjoner av operativsystemene som er nevnt ovenfor (også angitt i tabell for material).
The authors have nothing to disclose.
Celest utvikling ble støttet av NIH tilskudd R21AG027513 og U01AG045864. Data- og noen korte video representasjoner er tilpasset fra Restif et al. (2014) 8, som ble utgitt under den (CC BY) Creative Commons Attribution-lisens http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. Vi takker Ricardo Laranjeiro for manuskriptet hjelp.
REAGENT | |||
N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | C. elegans wild type (ancestral). | |
OP50 Escherichia coli | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Biosafety Level: BSL-1. | |
OP50-1 Escherichia Coli | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Streptomycin resistant strain of OP50. Biosafety Level: BSL-1. | |
Streptomycin sulfate salt | Sigma-Aldrich | S6501 | |
Printed Microscope Slides | Thermo Fisher Scientific | Gold Seal Fluorescent Antibody Microslides: 3032-002 | have two etched 10mm diameter circles delineated by white ceramic ink |
Nematode Growth Medium (NGM) | For 1L: 17g Agar, 3g NaCl, 2.5g Peptone, 1mL 1M CaCl2, 1mL 5mg/mL Cholesterol in ethanol, 25mL 1M KPO4 buffer, 1mL 1M MgSO4, H2O to 1 L. Sterilize by autoclaving. | Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook, 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1 (2006) | |
M9 buffer | For 1L: 3g KH2PO4, 6g Na2HPO4, 5g NaCl, 1mL 1 M MgSO4, H2O to 1 L. Sterilize by autoclaving. | Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook, 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1 (2006) | |
EQUIPMENT | |||
CeleST | Driscoll Lab, Rutgers University | C. elegans Swim Test | Open Source, see http://celestmod.github.io/CeleST/ and http://celest.mbb.rutgers.edu/ |
MATLAB | www.mathworks.com/downloads | MatLab version 2015b (best) | The CeleST version demonstrated here has best functionality with Mac OS 10.10 and MatLab 2015b. MATLAB 2015B introduced changes to how MATLAB handled graphics, including a new coding convention and syntax. These changes resolved an issue that couldn't be resolved elegantly (primarily because the internals of MATLAB really needed the major graphics overhaul implemented in MATLAB 2015B). For this reason, CeleST should always be run on MATLAB 2015B or later versions. However for users without access to MATLAB version 2015B or later (or MATLAB at all), we have created a CeleST program that doesn't need MATLAB on the computer at al. An installer is downloaded by the prospective user and then it installs itself onto the computer through a couple prompts like most programs. |
Mac OS | www.apple.com | Version 10.10 | Currently, CeleST has been ported to the major operating systems (Windows, Mac, and Linux). The current code can be run on any of the operating systems and there are versions for each operating system that don't even require users to have MATLAB to use CeleST (this version requires a large download). The Windows version has been tested the least and is most prone to bugs as such. Linux has been moderately tested. And Mac has been and continues to be tested extensively (primarily because it's the operating system in our lab). |
Stereomicroscope | Zeiss | Stemi 2000-C | |
Transmitted Light Base | Diagnostic Instruments | TLB 3.1 | |
Digital CCD Camera | QImaging | Rolera-XR Mono Fast 1394 (ROL-XR-F-M-12) | |
Digital Video Recording Software | Norpix | Streampix Version 3.17.2 |