Vacciniavirus (VV) har været meget anvendt i biomedicinsk forskning og forbedring af menneskers sundhed. Denne artikel beskriver en enkel, meget effektiv metode til at redigere VV genom ved hjælp af en CRISPR-Cas9 system.
The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been successfully employed for editing genomes of various organisms. Here we describe a protocol for editing the vaccinia virus (VV) genome in the cytoplasm of VV-infected CV-1 cells using the RNA-guided Cas9. RNA-guided Cas9 induces double-stranded DNA breaks facilitating homologous recombination efficiently and specifically in the targeted site of VV and a transgene can be incorporated into these sites by homologous recombination. By using a site-specific homologous vector with transgene(s), a N1L gene-deleted VV with the red fluorescence protein (RFP) gene incorporated in this region was generated with a successful recombination efficiency 10 times greater than that obtained from the conventional homologous recombination method. This protocol demonstrates successful use of RNA-guided Cas9 system to generate mutant VVs with enhanced efficiency.
Vacciniavirus (VV) er et kappebærende DNA-virus, der tilhører poxvirus familie og har spillet en afgørende rolle i et af de største resultater i medicin for udryddelsen af kopper. I den post-udryddelse æra af kopper, har VV blevet udviklet som en vektor til at levere gener til vacciner mod HIV og andre infektionssygdomme 1-7 ved at indsætte gener fra forskellige patogener i VV-vektorer. VV har også været udbredt anvendt som en vektor til cancerimmunterapi 8-14 især for udvikling af tumor-målrettede replikerende onkolytisk vacciniavirus. For at skabe en effektiv vaccine vektor med forbedret selektivitet for cancerceller, er modifikationer inden for virale genom kræves, herunder gen-deletioner eller introduktion af terapeutiske gener.
Med udviklingen af DNA-teknologi og en bedre forståelse af molekylær biologi og virologi, indsættelse af fremmed DNA i VV blev oprindeligt opnåd under anvendelse af homolog rekombination (HR) i 1980'erne 15. Denne metode er stadig udbredte til at konstruere VV vektorer. Indførelse af den genetiske modifikation opnås ved anvendelse af en shuttle vektor til HR, som rekombinerer med det VV-genomet i præ-inficerede celler. Imidlertid har denne metode vist sig at være meget ineffektive (under 1% homolog rekombination effektivitet 16) og resulterer ofte i tilfældig indsættelse af selektionsmarkør i ikke-målrettede regioner og / eller tab af markøren ved virus ekspansion.
Effektiviteten af DNA homolog rekombination til indsættelse af exogent DNA ved genomisk loci kan dramatisk forøget i nærvær af dobbelt-strenget pauser (DSBs) 17. Derfor er den teknologi, der kan fremkalde DSBs på target loci rummer et stort potentiale for genom engineering af VV.
Den nyligt udviklede CRISPR-Cas9 systemet viser lovende for at udløse DSB'er i enhver VV gen region. CRISPR-Cas9 er et RNA-guidet nuklease involveret i adaptiv immunitet mod invaderende fager og andre fremmede genetiske materialer 18-20. Der er tre CRISPR-Cas-systemer i en række mikrobielle arter 21. Type II CRISPR-Cas systemet er meget brugt til at redigere genomet af eukaryote celler og store vira. Den består af RNA-guidede Cas9 endonuklease (fra Streptococcus pyogenes), en enkelt guide RNA (sgRNA) og trans-aktiverende crRNA (tracrRNA) 22-24. Den Cas9 / sgRNA komplekset genkender den komplementære 20-nukleotid genomiske sekvens forud en 5'-NGG-3 'Protospacer tilstødende motiv (PAM) sekvens i pattedyrceller 22, 23. Det har været anvendt med succes til effektiv generering af genetisk modificerede celler, vira og dyremodeller 22-32.
Den CRISPR-Cas9 systemet har vist sig at være et effektivt redskab til genom målretning i kombination med homolog rekombination i cytoplasmaet i VV inficerede CV-1 celles til at generere mutant vacciniavira 33, 34. For at udvide den potentielle anvendelse af denne metode, præsenterer vi detaljerede oplysninger om systemets metode. Den beskrevne protokol kan bruges til at skabe en mutant VV med et bestemt gen deletion og / eller arm mutantvirusset med et terapeutisk transgen.
Der er to primære mål om ændring af VV til terapeutiske formål. Den ene er at slette et bestemt gen, såsom thymidinkinase (TK) genet til at dæmpe virus for anti-tumor terapeutisk anvendelse. Den anden er at arm VV med et ønsket terapeutisk gen (såsom GM-CSF) eller et markørgen (f.eks luciferasegenet). Opnåelse en af disse indebærer sletning af en target region / gen. En direkte DNA ligering metode 35 og en in vitro-pakning metode 36 er tidligere blevet anvendt til at generere mutant vacciniavira med TK gen modifikationer. Imidlertid har disse metoder begrænset anvendelse vedrørende mutation af andre regioner i genomet på grund af mangel af unikke restriktionsenzymsteder i hele genomet. Den nuværende fremgangsmåde til at skabe mutant VV involverer transfektion af en shuttle (donor) vektor med en selektionsmarkør (RFP eller GFP) i CV-1-celler to timer efter infektion med VV at inducere en homolog rekombination incorporating selektionsmarkøren i målområdet. Udvælgelse af markør-positive plaques efterfølges af deres oprensning 24 timer efter transfektion. Den plakoprensning proces kan tage op til 10 runder, sidste 3-4 uger og fører ofte til uønskede rekombinante vira med selektionsmarkører indsat i off-målregioner. DNA dobbelt-strengbrud effektivt kan inducere homolog rekombination i pattedyrceller 37, og ved at udnytte denne mekanisme, kan effektiviteten generere mutant VV forbedres kraftigt. Den gRNA-guidede Cas9 systemet er blevet ansat i genom redigering og forbedrer effektiviteten af homolog rekombination i eukaryote organismer 22, 25. For nylig, i værtsceller genomer adenovirus og type I herpes simplex virus blev redigeret af gRNA-guided Cas9 systemet 24. Det er for nylig blevet påvist, at CRISPR Cas9 systemet er et stærkt værktøj til effektivt at redigere VV-genomet og konstruere en VV-vektor til ekspression af etsærligt gen.
Både N1L gRNA-vejledt Cas9 og den traditionelle homolog rekombination (HR) metode resulterede i vellykket HR begivenheder på det samme mål site af N1L. Interessant, men gRNA-guided Cas9 induceret HR på langt højere niveauer af effektivitet end den traditionelle HR-metoden. Anvendelsen af gRNA-guided Cas9 eliminerer behovet for at oprense så mange plaques at opnå mutante vvs. I dette arbejde, vi markant forbedret effektivitet og tidsramme for generering af mutant VV bruge gRNA-guidede Cas9 systemet 33. Af note, et kritisk trin til opnåelse af en høj effektivitet af homolog rekombination er at transficere CV-1-celler med plasmider, der udtrykker Cas9 og gRNA i 24 timer før udførelse af konventionelle homolog rekombination. Den 24 timer interval giver Cas9 og gRNA at blive udtrykt på et rimeligt niveau. Endvidere kan gRNA sekvens målretter et særligt gen skal optimeres, da vi fandt, at de forskellige gRNA sekvenser targeting N1L gen varierede i deres effektivitet 33, 34.
Begrænsningen for CRISPR / Cas9 i redigering VV er den lave RFP-positive plaques i den første runde af rekombination. Til opnåelse af et tilstrækkeligt antal RFP-positive plaques indeholdende rekombinant virus, sædvanligvis mindst ti er behov 6-brønds plader, som gør første runde screening trættende. Derfor er der stadig behov for at optimere protokollen for at overvinde denne begrænsning.
Den lille størrelse af RFP-positive plaques er et andet potentielt problem, der skyldes en høj volumen af lysat anvendes til infektion af en plade med 6 brønde. For at overvinde dette, bør et mindre volumen af lysat anvendes til at inficere en plade med 6 brønde til opnåelse af større størrelse RFP-positive plaques. Ved hjælp af en mindre mængde lysat vil også gøre det muligt for en bedre separation af RFP-positive plaques fra RFP-negative. Derfor færre runder af plak rensning skal indhente rene RFP-positive plaques.
<pclass = "jove_content"> Off-target effekter er altid en uønsket problem i gen-redigering. CRISPR-Cas9 har vist off-target effekter. Men med omhyggelig udformning af gRNA, off-target effekter kan undgås ved redigering VV-genomer 33, 34. Dette er særlig fordel ved at bruge gRNA-styrede Cas9 system til redigering af genomet fra VV. I betragtning af de løfter VV, ved hjælp af CRISPR / Cas9 systemet vil fremskynde udviklingen af mutant vvs for biomedicinsk forskning og i translationel medicin. Endvidere ville et sådant system også fremskynde opdagelser i cellebiologi, såsom dissektion af signalveje anvendt af VV for sin actin-baserede motilitet.The authors have nothing to disclose.
This work was supported by The MRC DPFS grant (MR/M015696/1) and Ministry of Sciences and Technology of China (2013DFG32080).
Plasmid #41824 | 41824 | Addgene | gRNA cloning vector |
pST1374 | 13426 | Addgene | Cas9 cloning vector |
pGEMT easy | A1360 | promega | repair donor vector cloning |
One Shot TOP10 Chemically Competent E .Coli | C4040-10 | Invitrogen | transformation |
QIAprep Spin Miniprep Kit | 27106 | Qiagen | plasmid extraction |
Dulbecco’s Eagle’s Medium (DMEM) | 11965-092 | Life Technologies | cell culture medium |
fetal bovine serum (FBS) | SH30088.03HI | Hyclone | cell culture serum |
penicillin, streptomycin | 15070-063 | Thermo Scientific | antibiotics |
Effectene | 301425 | Qiagen | transfection |
Thermo Scientific Nalgene Cryogenic vial; 2.0 mL | W-06754-96 | Thermo Scientific | collect virus |
fluorescence microscope | Olympus BX51 Fluorescence | Olympus | find RFP-positive plque |
DNeasy Blood & Tissue Kit | 69506 | Qiagen | DNA extraction |
Extensor Long PCR ReddyMix Master Mix | AB-0794/B | Thermo Scientific | PCR reagent |
10cm culture dish | Z688819-6EA | sigma | cell culture |
6-well plate | Z707759 | sigma | cell culture |
cell scraper | C5981 | sigma | scrap cells |
1XTrypsin-EDTA solution | T4299 | sigma | trypsinize cells |
Virkon | 95015661 | Anachem Ltd | desinfectant |
Falcon tube | CLS430791-500EA | Sigma | hold cell suspension |
N1L forward 5’-TATCTAGCAATGGACCGT-3’ | Sigma | PCR primer | |
N1L reverse 5’-CCGAAGGTAGTAGCATGGA-3' | Sigma | PCR primer | |
A52R forward 5’-ATAGGATTGTGTGCATGC-3’ | Sigma | PCR primer | |
A52R reverse 5’-TTGCGGTATATGTATGAGGTG-3’ | Sigma | PCR primer | |
RFP forward 5’- GCTACCGGACTCAGATCCA-3’ | Sigma | PCR primer | |
RFP reverse 5’-CGCCTTAAGATACATTGATGAG-3’ | Sigma | PCR primer | |
Argarose | A7431 | Sigma | resolve PCR product |
G:BOX F3 | G:BOX F3 | Syngene | UV gel doc |