간단하고 효율적인 접근 방법은 돌연변이 백시 니아 바이러스 벡터를 구축하기

대상 RNA와 Cas9 구축 및 수리 기증자 벡터 1. 준비 gRNAs의 클로닝 앞서 설명한 25 원리 다음 백시 니아 바이러스의 N1L 유전자 타겟팅 가이드 RNA 표적 서열을 디자인. 백시 니아 바이러스의 게놈에 대한 가이드 RNA 표적 서열 정렬 (이 경우, 백시 니아 바이러스 리스터 균주를) 상관 오프 – 타겟 gRNA 표적 서열을 배제한다. 합성하고 이전 25 바와 같이 gRNA 클로닝 벡터 내로 gRNA 올리고 클론. 생거 시퀀싱 (33)에 의해 생성 된 벡터의 각 개별 gRNA의 순서를 확인합니다. 결과 gRNA이 gRNA N2 (33)로 구성 이름을 지정합니다. 주 : gRNA 대상 부위가 N1L 유전자 내이며, 왼팔, 오른쪽 아암 사이의 영역에 있다고 수리 공여체 벡터 커버 (도 1 참조). 에 핵 이행 시그널 (NLS)를 결여 Cas9 유전자를 복제pST1374 벡터와 PST-Cas9 (33)와 같은 구조를 지정합니다. 주 : 포유 동물 발현 벡터는 복제 Cas9 발현 벡터의 구축에 사용될 수있다. HR 수리 기증자 벡터의 건설 수정 (33)의 대상 영역으로 VV의 N1L 유전자를 사용합니다. 왼쪽과 오른쪽 팔의 길이는 약 500-600 bp의 각 대상 영역을 측면 있는지 확인합니다. 참고 : 왼쪽 팔 / 오른팔 대상 지역 50 bp의 중첩까지 가질 수있다 (그림 1 참조). 앞서 33, 34 바와 같이 N1L 영역 수리 공여체 벡터를 복제하고 PT-N1L로 수리 공여체 벡터를 나타낸다. 참고 : 수리 기증자 벡터와 그 대상 지역에 대한 그림 1을 참조하십시오. VV의 다른 영역은 영역 (유전자) – 특정 gRNA (들) 및 지역별 수리 기증자 벡터를 사용하여 대상이 될 수 있습니다. 모든 클로닝 벡터는 수리 공여체 벡터의 구축에 사용될 수있다. </OL> 플라스미드의 확장 화학적으로 관할 E.으로 플라스미드를 변환 콜라이 제조업체의 지시에 따라. 제조사에 의해 제공된 프로토콜 참조 플라스미드 추출 키트를 사용하여 플라스미드를 정제 하였다. 2. 시드 세포 (1 일) 유지 CV-1, 37 ℃에서 5 % 소 태아 혈청 (FBS), 100 U / ㎖ 페니실린, 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신이 보충 된 둘 베코 변형 이글 배지 (DMEM)에서 세포 (원숭이 신장 섬유 아세포), 5 % CO와 함께 2. 80-90% 합류 있습니다를 Trypsinize CV-1 세포 CV-1 세포를 함유하는 T-175 플라스크에서 세포 배양 배지를 제거한다. PBS를을 잔류 혈청을 제거하고 대기음하기 위해 멸균 PBS의 5 mL를 단일 층을 씻어. 세포를 커버하고 세포 분리를 돕기 위해 약 5 분 동안 37 ° C 배양기에서 플라스크를 배치 할 2.5 mL를 1 × 트립신 – EDTA 솔루션을 추가합니다. 더하다세포 배양 배지 10 ㎖의 부드러운 피펫 작용에 의해 세포를 중단한다 (단계 2.1 참조). 혈구를 이용하여 세포 수를 카운트. 6 웰 플레이트에 시드 셀 6 웰 플레이트의 각 웰에 세포 배양 배지 2 ㎖에 시드 2 × 105 CV-1 세포 트랜 스펙 션 전날. 참고 : 트립신을 제거하는 추가 원심 분리 단계는 필요하지 않습니다. Cas9 플라스미드 및 gRNA 플라스미드 3. 형질 (주 2) 0.5 μg의 PST-Cas9 플라스미드와 제조자의 지시에 따라 형질 감염 시약을 이용하여 0.5 μg의 gRNA N2 플라스미드 (단계 2.2.3.1에서 제조) 형질 CV-1 세포. 배양기에서 24 시간 동안 세포를 인큐베이션 (37 ℃, 5 % CO 2) (단계 2.1에 기재되어 있음) 새로운 세포 배양 배지로 2 ㎖의 배지를 교체한다. CV-1 세포 및 셔틀 기증자 V 4. 감염엑터 형질 HR에 대한 (3 일) 2 × 105 PFU / ml의 농도로 세포를 DMEM 배지로 백본 VVL15 바이러스 희석. Cas9 및 gRNA 플라스미드의 24 시간 후 형질 전환은 형질 CV-1 세포의 각 웰에 희석 바이러스의 100 μL를 추가합니다. 2 시간 후 바이러스 감염, 제조업체의 지침에 따라 형질 전환 시약을 사용하여 HR에 대한 VVL15 감염된 세포에 1.0 μg의 셔틀 기증자 벡터를 형질. 24 시간 동안 5 % CO 2와 37 ° C를 인큐베이터에서 형질 감염된 세포를 놓습니다. 5. 수확 재조합 바이러스 (4 일) 단계 4.2 HR위한 셔틀 도너 벡터 형질 감염 24 시간 후, 세포 스크래퍼를 이용하여 형질 감염된 CV-1 세포를 분리. cryovial에 세포 현탁액을 수집하고 나중에 사용하기 위해 -80 ° C에 저장합니다. 참고 : 즉시 살균제있는 모든 세포 배양 배지 유출을 닦아 다음 70 %이든 다시 닦아올. 수정 된 VV 6. 정제 (1 라운드) 1 일에, 아니라 각 3 × 10 5 CV-1 세포와 함께 15 6 웰 플레이트 씨앗. 제 2 일에, 3 분 동안 37 ℃ 수욕 단계 5.1에서 동결 된 세포 현탁액을 해동 및 세포 파편을 제거하지 않은 세포 용 해물을 얻기 위해 30 초 동안 격렬 크리오 바이알 (cryovial)을 소용돌이. CV-1 세포의 한 6- 웰 플레이트를 감염, DMEM 3 ㎖의 세포 용 해물 1 μL로 희석하고 이미 미디어의 위에, 6 웰 플레이트의 각 웰에 희석 된 세포 용 해물을 0.5 mL를 넣고 선물. 단계 6.1에서 제조 된 모든 6 웰 플레이트를 감염. 참고 : 세포 파편의 제거가 필요하지 않습니다. 감염 이틀 후에는 (즉, 4 일째), 플라크의 위치를 선회함으로써 마커 펜을 사용하여 플레이트 아래의 플라크 10X 대물 렌즈를 이용하여 형광 현미경 하에서 RFP 양성 플라크를 식별 라벨. 주 : <st룽> 대표 RFP 양성 플라크 그림 3. 여섯 가지 RFP 양성 플라크를 데리러 200 μL의 무 혈청 DMEM 세포 배양 배지를 포함하는 여섯 표시 크리오 바이알 (cryovial)를 준비합니다. 표지 된 플라크 (들) (단계 6.3)를 웰로부터 세포 배양 배지를 흡인. 하는 P200 피펫에 200 μL 팁을 부착 30 μL에 볼륨을 설정 한 cryovial에서 ~ 10 μL 세포 배양 배지을. 매체를 방출하지 않고 피펫 푸시 버튼을 누른 채 하나의 표지 플라크의 영역을 스크래치 팁을 사용합니다. 분리 된 세포를 위로 들어 올려 무 혈청 DMEM 190 μL를 포함하는 cryovial로를 전송 피펫 푸시 버튼을 놓습니다. (마지막 단계)에서 긁힌 세포와 유리 병에서 다른 10 μL 매체를 가지고 가능한 한 많은 긁힌 세포를 수집하기 위해 동일한 RFP 양성 플라크를 세 번 따기의 절차를 반복합니다. 같은 유리 병에 모든 세포를 전송하고 -80 ° C에서 유리 병을 저장합니다. <br /> 참고 : 정화의 두 번째 라운드가 즉시 수행되는 경우 또는, 10 분 동안 드라이 아이스에 크리오 바이알 (cryovial)을 동결. 수정 된 VV의 7 정제 (두 번째 라운드) 각에 씨앗 3 × 10 5 CV-1 세포 아니라 여섯 6 웰 플레이트와 문화를 24 시간 동안 세포. 3 분 동안 37 ° C의 물을 욕조에 (단계 6.3.3에서) 냉동 크리오 바이알 (cryovial)를 해동 후 세포 용 해물을 얻기 위해 30 초 동안 적극적으로 크리오 바이알 (cryovial) 와동. 6 웰 플레이트 잘 하나에 혼합 세포 용 해물의 0.5 μL를 추가합니다. 각 상패 하나의 6 웰 플레이트를 감염. 2 일 동안 5 % CO 2 (두 번째 라운드 상패 정화)와 37 ° C에서 VV 감염 6 웰 플레이트를 품어. 그런 다음 6.3 절을 반복합니다. 참고 : 이상 여섯 RFP 양성 플라크가 포착 될 수있다 둘 이상의 6- 웰 플레이트는 각각의 플라크 정제를 위해 사용될 수있다. 플라크 푸리 8. 또한 라운드문법 없애기 하나의 양성 플라크 형성 모든 플라크 현미경 RFP 양성인 것으로 나타날 때까지 단계 7에 기재된 동일한 프로토콜 다음 정제의 또 3-5 라운드에서 수행한다. 참고 : 다음이 플라크가 순수한 것으로 간주됩니다. 플라크는 순수되면 6.3 절에 설명 된대로 (그림 4, RFP를 표현하는 모든 감염된 세포), -80 ° C에서 cryovial 및 저장에 긍정적 인 플라크를 수확. 단계 9와 10에 설명 된 프로토콜을 다음과 플라크를 확인합니다. 9. 확장하고 정제 된 플라크 (들) 바이러스 감염 전에 6 웰 플레이트 1 일 각 웰에 씨 3 × 10 5 CV-1 세포. 세포 용 해물을 얻기 위해 3 분 동안 37 ° C의 수조에서 8.2에서 동결 해동 cryovial. CV-1 세포의 6 웰 플레이트 잘 하나에 (세포 파편을 제거하지 않고) 모든 해물을 추가한다 (단계 9.1에서 시드). 5 37 ° C에서 감염된 CV-1 세포를 품어최대 3 일 %의 CO 2. 모든 정제 된 플라크 (적어도 세 플라크)를 확장합니다. 주 : 감염 시간 해물에서 바이러스의 양에 따라 1-3일 다르다. 50 % 이상의 세포들이 현미경 하에서 관찰 된 세포 변성 효과 (CPE)를 나타낼 때, 셀 스크레이퍼를 사용하여 VV 감염된 세포를 수확 (세포는 쉽게 분리 및 RFP 긍정적 반올림). 15 ㎖의 튜브에 세포 배양 배지와 함께 분리 된 세포를 수집한다. 3 분간 300 g에서 원심 분리하여 세포를 펠렛. 상층 액을 제거하고 더 사용할 때까지 -80 ° C에서 세포 펠렛을 유지하거나 10 단계 즉시 세포 펠렛을 사용합니다. PCR을 사용하여 돌연변이 VV의 수정 10. 확인 제조 업체의 프로토콜을 따르는 DNA 추출 키트를 사용하여 단계 9.3.1에서 제조 된 세포 펠렛에서 VV DNA를 추출합니다. 두 번 증류수 200 μL와 DNA를 용출. 참고 : DNA를 추출하고 복제가 올바른 수정 / 삽입이 포함 된 것으로 확인되면 바이러스 생산을 위해 나머지를 유지하기 위해 펠릿의 볼륨의 절반을 사용합니다. N1L 유전자의 삭제와 N1L 영역으로 RFP 유전자 삽입 확인. N1L 유전자 (L025)와 N1L 유전자에 대해 고안된 프라이머를 사용하여 유전자 L026 걸친 DNA 단편을 증폭한다. RFP 특이 프라이머를 사용하여 RFP 유전자를 증폭한다. A52R 특이 적 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 A52R 걸친 제어 DNA 단편을 증폭한다. 참고 : 특정 프라이머에 대한 자료 목록을 참조하십시오. PCR의 마스터 믹스 키트를 사용하여 PCR을 수행한다. 25 μL DNA 템플릿의 2 μL를 사용하여 PCR 반응 세트, 2 분 동안 94 ° C에서 PCR 반응을 변성 한 후 다음 단계에 따라 PCR의 30주기를 실행 : 15 초 동안 94 ° C에서 DNA를 변성 후, 어닐링 15 초 동안 52 ° C에서 DNA 템플릿에 프라이머는 30 초 72 ° C에서 PCR 반응을 확장합니다. 1 % 아가로 오스 겔 (33)을 사용하여 PCR 산물을 해결. 자외선 겔 문서를 사용하여 겔 이미지를 캡처. N1L PCR이 부정하고 A52R 및 RFP의 PCR 양성이면 플라크 올바르게 N1L 영역으로 변경된다.