An example of adenoviral gene therapy in the human diabetic organ-cultured corneas is presented towards the normalization of delayed wound healing and markedly reduced epithelial stem cell marker expression in these corneas. It also describes the optimization of this process in stem cell-enriched limbal epithelial cultures.
Bu protokolün amacı, insan diyabetik kornealar moleküler değişiklikleri tanımlamak ve organ kültürlü kornealar adenoviral gen tedavisi ile kontrol altına alınabilir nasıl göstermektir. Diyabetik kornea hastalığı kornea sinir ve epitel yara iyileşmesi sık anormallikler diyabet komplikasyonudur. Biz de insan diyabetik kornealar birçok olası epitel kök hücre belirteçleri önemli ölçüde değişmiş ifadesini belgelenmiştir. Bu değişiklikleri hafifletmek için adenoviral gen terapisi başarıyla c-met proto-onkogen ifade düzenlenmesi ve / ya da proteinazlar, matris metaloproteinaz-10 (MMP-10) ve katepsin F. Bu tedavinin down-regüle kullanılarak uygulanan diyabetli kornea yara iyileşmesi hızlandırılmış sadece limbal kök hücre bölmesi transduse zaman bile. En iyi sonuçlar, kombine terapi ile elde edilmiştir. normalize kök hücrelerin mümkün olan hastaya nakli, bir örnek, optimizati arasında sunulmuşturpolikatyonik güçlendiricileri kök hücre ile zenginleştirilmiş kültürlerde gen transdüksiyonu on. Bu yaklaşım, seçilen genler için değil, aynı zamanda kornea epitel yara iyileşmesinin diğer arabulucular için sadece yararlı olabilir ve hücre fonksiyonu kaynaklanıyor olabilir.
Diyabetik kornea hastalığı çoğunlukla dejeneratif epitel (keratopatisi) ve sinir (nöropati) değişikliklere neden olur. Genellikle epitel yara iyileşmesi ve kornea sinir azaltma 1-4 anormallikler ortaya çıkar. Tahminen% 60-70 diyabet çeşitli kornea problemleri 1,3 var. Çalışmalarımız değiştirilmiş Cı-met proto-onkogen (hepatosit büyüme faktörü reseptörü) ile aşağı doğru düzenleme dahil olmak üzere insan diyabet kornea ekspresyon ve matris metaloproteinaz-10 (MMP-10) ve katepsin F 5, 6, yukarı doğru düzenleme ile birkaç işaretçi proteinleri tanımlanmıştır. Biz de önemli ölçüde belgelenmiş insan diyabetik kornealar birçok olası epitel kök hücre belirteçleri ifadesini azalmıştır.
Daha önceki çalışmalarda diyabetik, yavaş yara iyileşme gösterir Diyabet kornea organ kültür sistemi kullanılarak şeker-değiştirilmiş belirteçlerin seviyelerini normalize etmek üzere bir adenoviral esaslı gen terapisi geliştirdikişaretleyici değişiklikler ve ex vivo kornealar 7,8 benzer hücre belirteci ifade azaltma kaynaklanıyor. Değişikliklerin Bu sebat epigenetik metabolik belleğin 9 varlığından dolayı görünmektedir. Bu kültür sistemi gen terapisi için daha kullanılmıştır. Bu tedavi için hedef diyabetik kornealar (c-met proto-onkogen) veya artmış ekspresyonu (MMP-10 ve katepsin K) azaltılmış ekspresyonu ile ya belirteçleri seçilmiştir.
adenoviral (AV) tedavisi tüm organ kültür kornealar veya sadece korneoskleral periferik limbal bölmeye kullanılmıştır. Bu bölme kornea epitel yenilemek ve aktif 4,10-15 yara iyileşmesi katılmak epitel kök hücreleri barındırır. Burada, protokoller, normal sağlıklı insan kornea organ kültürü, epitelyal yara iyileşmesi, izolasyon ve kök hücre zenginleştirilmiş limbal hücre kültürlerinin karakterizasyonu ve adenoviral hücre ve kornea transdüksiyon için verilmiştir. BizimSonuçlar gelecekteki olası transplantasyon için diyabetik kornea işaretleyici ifade ve yara iyileşmesi normalleştirilmesi için bu tedavinin uygulanabilirliğini göstermektedir. Onlar da kombinasyon tedavisi, diyabetik kornea 16-18 normal işaretleyici desen ve epitel iyileşmesini geri en etkili yol olduğunu göstermektedir.
Kornea bağlı gen verici, hem de etkinliği ve yan etkilerin değerlendirilmesi kolay yüzey konumuna gen terapisi için ideal bir doku gibi görünmektedir. Ancak, bu güçlü bir yaklaşım klinik çevirisi genetik kornea hastalıklarının nedenleri ve gen tedavisi hedefleri 24 kıt bilgilere hala yavaş. Korneal değişiklikler de dahil olmak üzere Diyabetik komplikasyonlar metabolik belleğe 9 çevirir doğada, büyük ölçüde epigenetik olabilir. Bu nedenle, diyabet dokular ve hücreler, …
The authors have nothing to disclose.
We gratefully acknowledge financial support by NIH/NEI R01 EY13431 (AVL), CTSI grant UL 1RR033176 (AVL), and grants from the Regenerative Medicine Institute, Cedars-Cedars Medical Center.
minimum essential medium | Thermo Fisher Scientific | 11095-080 | |
Optisol-GS | Bausch & Lomb | 50006-OPT | |
ABAM antibiotic-antimycotic mixture | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
calf skin collagen | Sigma-Aldrich | C9791 | |
agar, tissue culture grade | Sigma-Aldrich | A1296 | |
n-heptanol | Sigma-Aldrich | 72954-5ML-F | |
O.C.T. compound | VWR International | 25608-930 | |
Dispase II | Roche Applied Science | 4942078001 | |
keratinocyte serum-free medium (KSFM) | Thermo Fisher Scientific | 17005042 | |
EpiLife medium with calcium | Thermo Fisher Scientific | MEPI500CA | |
N2 medium supplement, 100x | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
B27 medium supplement, 50x | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
human keratinocyte growth supplement, 100x | Thermo Fisher Scientific | S-001-5 | |
trypsin 0.25% – EDTA 0.02% with phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
trypsin 0.25% with phenol red | Thermo Fisher Scientific | 15050065 | |
soybean trypsin inhibitor | Sigma-Aldrich | T6414 | |
fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
insulin-transferrin-selenite supplement (ITS) | Sigma-Aldrich | I3146-5ML | |
antibody to keratin 14 | Santa Cruz Biotechnology | sc-53253 | |
antibody to keratin 15 | Santa Cruz Biotechnology | sc-47697 | |
antibody to keratin 17 | Santa Cruz Biotechnology | SC-58726 | |
antibody to ΔNp63α | Santa Cruz Biotechnology | sc-8609 | |
antibody to PAX6 | BioLegend | PRB-278P-100 | |
antibody to nidogen-1 | R&D Systems | MAB2570 | |
antibody to integrin α3β1 | EMD Millipore | MAB1992 | |
human fibronectin | BD Biosciences | 354008 | |
human laminin | Sigma-Aldrich | L4445 | |
human type IV collagen | Sigma-Aldrich | C6745-1ML | |
adenovirus expressing MMP-10 shRNA | Capital BioSciences | custom made | |
adenovirus expressing cathepsin F shRNA | Capital BioSciences | custom made | |
adenovirus expressing scrambled shRNA and GFP | Capital BioSciences | custom made | |
adenovirus expressing c-met | OriGene (plasmid) | SC323278 | |
adenovirus expressing GFP | KeraFAST | FVQ002 | |
sildenafil citrate, 25 mg | Pfizer | from pharmacy | |
epidermal growth factor | Thermo Fisher Scientific | PHG0311 | |
poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
polybrene | Sigma-Aldrich | 107689-10G | |
ViraDuctin | Cell Biolabs | AD-200 | |
ibiBoost | ibidi, Germany | 50301 | |
phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | |
Corning round end spatula | Dow Corning | 3005 | |
60-mm petri dishes | Thermo Fisher Scientific | 174888 | |
Nunc Lab-Tek II multiwell chamber slides | Sigma-Aldrich | C6807 | |
200 microliter pipet tips | Bioexpress | P-1233-200 | other suppliers available |
inverted microscope | Nikon | Diaphot | other suppliers/models available |
humidified CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 370 (Steri-Cycle) | other suppliers/models available |
fluorescent microscope | Olympus, Japan | BX-40 | other suppliers/models available |
dissecting stereo microscope | Leica, Germany | S4 E | other suppliers/models available |