치킨 청각 기관에 유전자 전달에 의한<em> 비켜에서</em> 마이크로 전기
Summary
The auditory organ mediates hearing. Here we present a modified in ovo micro-electroporation method optimized for studying auditory progenitor cell proliferation and differentiation in the developing chicken auditory organ.
Abstract
닭 배아 유전자 기능의 조작은 오보에서 비교적 용이하게 수행 될 수있는 배아 발달 공부 이상적인 모델 시스템이다. 내이의 청각 감각 기관들을 수있는 우리의 능력 중요합니다. 그것은 지원 세포 (희주) 아교와 같은 고도로 전문화 된 감각 HCS () – 기계 열 변환 유모 세포로 구성되어 상피와 주변 주택. 청각 기관의 구조적인 차이에도 불구하고, 청각 기관의 발달을 조절하는 분자 메커니즘이 진화 포유 동물과 AVES 사이에 보존되어 비켜 전기에서 E1의 초기 단계에 크게 제한된다 -. E3. 때문에 E5의 청각 기관의 상대적으로 늦게 개발, E3 과거 비켜 전기에 의한 청각 기관의 조작으로 인해 나중 단계에서 닭 배아의 고급 개발에 어렵습니다. 여기에 제시된 방법은 관심 유전자를 타겟팅하는 일시적 유전자 전달 방법단계 E4 – 비켜 마이크로 전기의를 통해 개발 치킨 청각 감각 기관에 E4.5. 이 방법은 이득 – 및 상실 함수 종래의 플라스미드 DNA 계 발현 벡터를 적용하고 상기 전체 배아 EDU (5-에 티닐 -2'- 데 옥시 우리 딘)을 첨가하여 오보 세포 증식 분석에서 결합 될 수있다 전기의 시간입니다. 녹색 또는 적색 형광 단백질 (GFP 또는 RFP) 발현 플라스미드의 사용은 실험 신속 전기 성공적 현상 내이의 청각 부를 대상 여부를 판단 할 수있다. 이 방법 논문에서는 GFP 전기 천공 표본의 대표적인 예는 예시; 전기 후 96 시간과 청각 기관의 프로 감각 영역에 GFP의 대상은 현장 하이브리드의 RNA에 의해 확인되었다 – 배아는 18을 수확했다. 이 방법은 종이 셀 prolif를 분석 듀 아날로그 티미 딘의 사용을 위해 최적화 된 프로토콜을 제공한다eration; 면역 라벨링을 결합 듀 화학을 클릭했을 듀 계 세포 증식 분석의 예를 제공한다.
Introduction
포유류 및 조류 청각 감각 기관 사이의 형태 차이 및 세포 패턴에도 불구하고, 분자 요인과 감각 HC의 개발을 담당 경로는 진화 1-3 보존 될 것으로 생각된다. 청각의 HC와 그 주변으로 SC를 수용하는 기저 유두는, 내부 귀 otocyst의 outpocketing으로 개발하고 있습니다. 초기 HC 및 SC 조상의 풀은 귀의 placode / 귀 컵 신경 감각 능력 도메인 (NSD) 내에서 지정됩니다. 운명 매핑 데이터는 신경 및 감각 계통이 연결과 귀 컵의 안테 – 복부 지역에 위치한 나 마우스와 치킨 4,5에 otocyst NSD에서 발생된다는 증거를 제공. 먼저 neuroblasts 결국 청각 및 전정 신경으로 분할 청각-전정 신경절의 뉴런을 야기 할 NSD로부터 박리. 이 신경은 뇌간에있는 내이 및 핵의 감각의 HC를 신경을 분포시키다. 세포 일NSD에 남아있는 열 변환 – 기계 감각의 HC 및 연관된으로 SC 구성된 청각의 감각 기관을 포함하는 다양한 관능 패치를 야기 할 것으로 생각된다.
병아리와 쥐 모두에서, 청각 기관의 감각 전구 세포주기 출구와 HC 차별화 그라디언트 반대에서 발생합니다. 병아리 청각 전구 세포주기 종료 ~ E5 주위 시작 기저부로부터 꼭지점까지 진행하고, 중심으로부터 외주 6. 어느 날 이후, HC 차별화가 정점에서 시작베이스 (7)에 진행한다. 작용 메커니즘이 복잡한 수술을 필요로 다른 모델 시스템에서의 자궁에 배아 조작 반대로 오보에서 비교적 용이하게 조사 할 수 있기 때문에 닭 내이의 개발 공부 많은 기술적 장점을 제공한다. 여기에 설명 된 방법은 추정 basila에 대한 관심의 유전자를 대상으로 비켜 마이크로 전기에 사용특히 E4에 귀의 소포의 연구 유두 영역 전방 – 복부.
OVO의 전기가 잘 설립하고 일반적으로 8-14를 사용하는 기술이다. 일렉트로 기술의 원리는 뉴클레오티드 (예를 들면, 플라스미드 DNA, 합성 DNA 또는 RNA 올리고 뉴클레오티드) 음으로 하전된다는 사실에 기초한다. 한 DNA는 관심있는 조직으로 주입된다. 전류는 조직을 통해 배치 될 때, 전류는 셀 벽에서 과도 모공을 열어 상기 음으로 하전 된 DNA는 양극 (애노드)을 향하여 흐를 때 상기 DNA의 흡수를 허용한다. 이득의 기능 실험을 위해, 관심의 유전자는 일반적으로 녹색 형광 단백질 (GFP) 또는 적색 형광 단백질 (RFP)에 적합한 발현 카세트를 포함하는 발현 플라스미드에 서브 클로닝된다. 손실의 기능 실험 플라스미드 기반의 지배적 인 부정적인 리프레 구조, 또는 RNAi의, 또는 모르 폴리 노의 구조를 들어 C는ommonly는 15, 16을 사용했다. 플라스미드 계 전형적 마이크로 RNA (miRNA의) 기능의 miRNAs 스폰지 구조를 억제하기 위해 17 사용될 수있다. 오보 마이크로 전기 천공 방법에서의 용이 전체 배아 듀를 추가 오보 세포 증식 분석에서 결합 될 수있는 여기에 기술 된 방법은 청각 기관의 증식 및 분화를 조절하는 분자 메커니즘을 조사 할 수있다.
일렉트로과 에두의 추가는 어느 날 청각 기관의 세포주기 출구의 시작 앞에있는 귀의 소포에 E4에서 수행됩니다. 일반적으로 18 수행되는 청각 기관의 분석 – (HC 분화시) E5 (감각 전구 세포주기 출구의 시작), E6 (HC 차별화의 시작)와 E7에서 전기 후 96 시간을; 이상 ~ E9 (HC 차별화 끝)까지. 유전자 전달이 전기 천공 방법은 ~ 4 일 정도 지속 일시적인 becauSE는 관심 유전자가 게놈 내로 통합되지 않지만, 상기 방법은 TOL2 매개 유전자 전달 (11)의 게놈 내로 통합하는 능력이 있는가 적절한 플라스미드 DNA 계 발현 벡터와 함께 사용하기 위해 적용 가능하다. 이 방법 강력한 GFP 또는 RFP 발현 지속 ~로 신호를 가리 페이드, 아직 청각 기관의 복잡한 현상을 연구하기 위해 충분한 시간 창을 제공 한 후, 달팽이관 4 일. 비켜 유전자 전달 방법이 소설 특히 청각 기관에 HC 개발에 초점 조사에 최적입니다 E4에서 추정 청각 기관을 대상으로 할 수 있습니다. 훨씬 이하의 개발 단계 (11, 12) 또는 기저 관내 유두 이식편 배양 물 (18)의 사용에 비해 electroporate 다른 방법에 좋은 재료이다.
Protocol
Representative Results
Discussion
오보 마이크로 일렉트로에서의 여기에 설명 된 방법은 현상 청각 기관으로의 유전자 전달에 대해 최적화되어있다. 그것은 일반적으로 유전자 기능 / 발현을 조작하는 데 사용되는 플라스미드 DNA 계 발현 벡터와 호환된다. E4에서 전기의 타이밍은 청각 기관에서는 HC 개발에 집중 조사에 적합하다. 가장 중요한 단계는 바늘 너무 깊이 가서 귀의 소포를 손상시키지 않고 귀의 소포 루멘…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 발현 플라스미드과 현장 프로브 박사 도리스 K. 우 감사, 감각 생물 이미징 시설의 존스 홉킨스 대학 센터와 청력과 균형을위한 센터. 이 작품은 LE에 NIDCD 부여 T32 DC000023에 의해 지원되었다
Materials
| Sterile 1x PBS pH 7.4 | gibco | 10010-023 |
| Fast Green FCF Powder | Sigma | F7252-5G |
| EdU Powder | Invitrogen | E10187 |
| Click-IT EdU Alexa Fluor 555 Imaging Kit | Invitrogen | C10338 |
| HiSpeed Plasmid Midi Kit (25) | Qiagen | 12643 |
| ECM 830 ElectroSquarePorator | BTX Harvard Apparatus | |
| Banana to Micrograbber Cable Kit | BTX Harvard Apparatus | 45-0216 |
| Right Handed & Left Handed Micromanipulators | World Precision Instruments Inc. | M3301R & M3301L |
| Two 12 mm Magnetic Holding Device Stages with 7 inch vertical posts | World Precision Instruments Inc. | M10 |
| Metal Steel Base Plate 12×24 inch | World Precision Instruments Inc. | 5479 |
| Scissors for Eggs 12 cm long curved, 12 mm extrafine blades; Spring Scissors | World Precision Instruments Inc. | 14120 |
| Micropippette Puller for pulling needles | Sutter Instrument Co. | P-97 |
| 2.5×2.5 mm Box Platinum Heating Filament | Sutter Instrument Co. | |
| Glass Capillary Tubes/Needles/No Fiber/Borosil 1 mm | FHC | 27-30-0 |
| Hamilton Glass Syringe 100 μl | Hamilton | 80601 Model 710LT |
| Mineral Oil (Heavy) for Hamilton Glass Syringe | Fisher Scientific | O122-1 |
| Polyethylene Tubing for connecting the Glass Syringe and Glass Cappillary Needles/ Non Toxic | Becton Dickinson and Company (BD) | 427420 Intramedic Clay Adams Brand |
| 3 cc Disposable Syringes | Becton Dickinson and Company (BD) | 309657 |
| Disposable 21 Gauge Needles | Becton Dickinson and Company (BD) | 305122 |
| One pair of 2 mm Platinum Electrodes | Bulldog Bio. / Nepagene | CUY611P3-2 |
| Electrode Holder | Bulldog Bio. / Nepagene | CUY580 |
| One pair of Dumont fine forceps number 5 | Fine Science Tools (FST) | |
| Matte finish invisible tape for sealing eggs | Office Depot | 520-928 |
| Cotton-Tipped Swabs | Fisher Scientific | 23-400-101 |
| Sterile filter tips |
Referencias
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