inkapselen van cytochroom<em> c</em> In Silica Aerogel nanostructuur zonder Metal Nanodeeltjes met behoud van Gas-fase bioactiviteit

Veiligheidsbril, labjas en laboratorium handschoenen worden gedragen op elk moment tijdens de procedure. Gebruik nooit het kritieke punt drooginrichting zonder een veiligheidsbril. Alle oplossingen die tetramethoxysilaan, methanol, ethanol, aceton, ammoniak en moeten binnen een zuurkast worden verwerkt. 1. Zorg Buffer en Cyt. C Solutions Ervoor ~ 750 ml pH 7, 40 mM kaliumfosfaatbuffer, eerst bereiden 500 ml 0,04 M monobasisch kaliumfosfaat door weging uit 2,72 g monobasisch kaliumfosfaat en oplossen in water met een 500 ml maatkolf. Bereid 500 ml 0,04 M dibasisch kaliumfosfaat door weging uit 3,48 g dibasisch kaliumfosfaat en oplossen in water met een 500 ml maatkolf. Giet het dibasische zoutoplossing in een grote bak met een roerstaaf en beginnen roeren van de oplossing op een roer plaat. Voeg langzaam delen van het monobasisch zout sPLOSSING de dibasische zoutoplossing tijdens het monitoren van de pH met een pH-elektrode en meter tot de pH 7,00. Ongeveer 250-300 ml van de monobasische zoutoplossing gebruikt. Weeg ongeveer 0,023 g cyt. C en plaats in glazen scintillatieflesje. Voeg 2000 ul geprepareerde kaliumfosfaatbuffer met een micropipet en dan zachtjes wervelen van de oplossing te mengen totdat alle vaste, rode cyt. C is opgelost in de oplossing en er geen deeltjes blijft. Neem 20 ul van de bereide cyt. C-oplossing en toe te voegen aan een 1 cm padlengte plastic cuvet. Voeg 3 ml van bereide buffer. Neem UV-vis spectrum 300-700 nm met behulp van buffer in de referentie-cel. Gebruik de cyt. C absorptie (A) bij 409 nm, de extinctiecoëfficiënt 31 (ε) van 106.100 M-1 cm -1, de lengte cuvette pad (l), en de Beer-Lambert wet om de concentratie te bepalen (c) van de oplossing (A = εlc). Terug Bereken de titer van de oorspronkelijke bereide oplossing. De 2 ml bereid cyt. C oplossing ligt typisch tussen 0,7-0,9 mM concentratie. Verdun de oorspronkelijke bereid cyt. C oplossing van 800 gl 0,105 mM pipetteren 117 pi 0,72 mM bereid cyt. C oplossing in een scintillatieflesje. Voeg vervolgens de rest van de 800 pl (683 pl in dit geval) van bereide buffer. Swirl te mengen. De precieze hoeveelheden zullen variëren afhankelijk van de precieze concentratie van de oorspronkelijke bereid cyt. C oplossing als het volume van cyt. Com pipet wordt berekend als (800 pi * 0,105 mM) / (oorspronkelijke cyt. C concentratie in mM). Bewaar originele voorbereid en verdund cyt. C oplossingen bij 2-8 ° C in een koelkast totdat klaar om te gebruiken voor maximaal twee weken. 2. Synthetiseren Silica (SiO 2) Sol Label een wegwerp 50 ml polypropyleen beker 'BeAker A '. Plaats de beker op de pan van een analytische balans en gebruik een glas Pasteur pipet om 1,88 g tetramethoxysilaan toe te voegen in de beker. Zero de balans en vervolgens pipet 2,88 g methanol in 'Beaker A'. Cover 'Beker A' met Parafilm. Label een wegwerp 50 ml polypropyleen beker 'Beaker B'. Voeg een magnetische roerstaaf en leg ze op de pan van een analytische balans. Gebruik een glazen pipet tot 0,75 g water en 3,00 g methanol toe te voegen. Cover 'Beaker B' met Parafilm. Begin met het roeren van de inhoud van 'Beaker B' op een roer plaat in een zuurkast, gebruik dan een spuit om 5 ul van 28,0-30,0% ammoniumhydroxideoplossing steek door de Parafilm te dekken in het mengsel al roerend. Zodra 2,5 stap is voltooid, voeg de inhoud van "Beker A" tot "B beker. Roer het mengsel gedurende 20 minuten onder bedekt met Parafilm. 3. Bereid Gel Mallen Let op: Ertijd om de gel vormen werken en daarbij de silicasol mengsel roeren in stap 2,6. Acquire 8-9 polypropyleen scintillatieflesjes (16 mm x 57 mm, grootte van het volume 6,5 ml, met bodems afgesneden) en de bijbehorende caps. Doe plasticfolie over de dop einde van het flesje op een vlakke ondergrond te creëren voor de gel te vormen op en plaats de kap erover om ervoor te zorgen dat de plastic verpakking blijft intact in de dop. Line-up van de flesjes met cap-end op de bank top en opende bodems naar boven. 4. Bereid Cyt. C -silica Sol-gels Na voltooiing van de sol te mengen (stap 2,6), voeg 3 ml van de sol naar een schone 50 ml wegwerp polypropyleen beker. Gebruik een glazen pasteurpipet langzaam dalen 500 gl van de verdunde 0,105 mM cyt. C oplossing (in stap 1,9) aan de 3 ml sol mengsel in de loop van ~ 1 min. Zorg ervoor dat u zachtjes wervelen het mengsel tijdens het toevoegen van de cyt. C om vorming van grote voorkomenrode klonten. Ervan uitgaande dat de volumes additief, door het verdunnen van 500 pl van de 0,105 mM cyt. C oplossing van 3500 ui, de cyt. C concentratie nu de sol in theorie 15 uM. Pipetteer 0,5 ml van de resulterende cyt. C silicasol in elk voorbereide vorm. Pipetteer ook 0,5 ml resterende 'plain' silicasol in één of twee matrijzen gebruikt als controlemonsters tijdens het superkritisch drogen. Bedek de face-up openingen van de mallen met Parafilm en zet in de koelkast (~ 2-8 ° C), 's nachts of gedurende ten minste 12 uur tot sol-gels te produceren. Neem de mallen uit de koelkast. Verwijder de Parafilm uit de top van een matrijs met een cyt c sol-gel.; Ook de dop en plastic verpakking van de bodem te verwijderen. Na toevoegen van enkele ethanol uit een wasfles in de mal, gebruik de ronde schijf uiteinde van een zuiger voorzichtig duwen de gel uit de vorm en in een schone 20 ml glazen scintillatieflesje containing ongeveer 5 ml ethanol. Herhaal deze procedure gel verwijderd (stap 4,5 en 4,6) totdat alle cyt. C gels worden toegevoegd aan het flesje en alle silicagels worden toegevoegd aan een afzonderlijk flesje. Als er meer dan een concentratie van cyt. C gel is gemaakt, moet u om samen op te slaan, zoals gels in afzonderlijke flacons. Vul dan de flesjes naar de top met ethanol, cap en op te slaan tussen 2-8 ° C. Om de vier uur gedurende de dag, verwijder de gels uit de koelkast, giet de ethanol uit de gels en te vervangen door verse ethanol. Gedurende een aanvullende drie dagen onderdompelen natte sol gel in aceton, decanteren en het toevoegen van verse aceton driemaal daags. 5. Supercritically Dry Cyt. C -silica Sol-gels Cool Een kritisch punt drooginrichting (zie figuur 1) tot 10 ° C door de temperatuur van een aangesloten circulator tot 8 ° C. Zodra de inrichting reached 10 ° C, uitvoeren van een lektest op het toestel door het vullen van een overschrijving boot met aceton en dichten de binnenkant van de inrichting. Open de vulklep van de inrichting en voeg kooldioxide tot de inrichting halfvol. Sluit de vulklep en luister aandachtig voor sissen bij de deuren en kleppen waar de O-ringen of afdichtingen kunnen verslechteren. Vervang O-ringen of afdichtingen wanneer een lek wordt gevonden. Na het voltooien van de lektest, open de aftapkraan aan de aceton en kooldioxide vrijkomen in de afvoer van een zuurkast. Verwijder vervolgens de overdracht boot uit het apparaat. Nadat verzekerd is dat de inrichting lekvrij, giet de natte gels van de scintillatieflesjes, samen met de meeste aceton, in drie lange stukken overdracht boot (specimen manden of gaas bekledingen zijn niet nodig). Tactvol duwen en verplaats de gels in de boot met een tang om ervoor te zorgen dat alle gels ik volledig ondergedompeldn aceton. Voeg meer aceton indien voor het afdichten van de boot in de inrichting nodig. Open de vulklep van de inrichting kooldioxide toe, open de aftapkraan aceton zodra de aceton mengen met het kooldioxide waargenomen zinken naar de bodem van de inrichting door de inrichting raam vrij vijf minuten. Dit sijpelen aceton naar beneden zal plaatsvinden voordat de inrichting volledig is gevuld met kooldioxide, zodat de vulklep open voor zover nodig tijdens het aftappen moet blijven, zodat de inrichting zal vullen, zelfs als de afvoer geopend. Sluit de afvoerkraan. Houd de vulklep gekraakt een beetje open. Vijf minuten later, opent de afvoerklep gedurende vijf minuten en pas het vulklep voldoende geopend zodat de inrichting volledig gedurende de hele tijd blijft aftappen. Sluit de afvoerkraan, houdt de vulling open klep gekraakt, herhaal dit aftappen stap nog een keer vijfminuten later. Na deze eerste drie stappen drainage, opent de afvoer gedurende 5 min per keer ongeveer elke 40 minuten over de overspanning van tenminste zes uur volledige vervanging van aceton door vloeibaar kooldioxide in de gels te waarborgen. Stel het vulklep open genoeg tijdens elke aftappen zodat het vloeistofniveau in de inrichting nooit beneden de bovenkant van de boot bij het aftappen. Zodra het aftappen stappen zijn voltooid, sluit de vulklep, en laat de vloeibare kooldioxide, zodat het niveau zichtbaar blijft net boven de tanden op de boot door te kijken door de inrichting raam. Stel de temperatuur van het toestel dient circulator tot 40 ° C om ervoor te zorgen dat de vloeibare kooldioxide stijgt boven de kritische temperatuur en druk (Tc = 31 ° C; Pc = 7,4 MPa). Na ongeveer 15 minuten, observeert de overgang van vloeistof naar superkritisch fluïdum door de inrichting venster waarin de vloeistof meniscons boven de tanden van de boot verdwijnt. Laat minstens 15 min equilibratie tijd, dan opent u de ontluchtingsklep een klein bedrag om te beginnen met de superkritische vloeistof vrij te geven. Gedurende ongeveer 45 minuten, blijven stapsgewijs openen ontluchtingsklep wijder zodat een stabiel, maar zeer lage ruis vrijgeven fluïdum te horen en de drukmeter wordt waargenomen langzaam afnemen tot nul. Nadat de druk van de inrichting is naar nul, opent het apparaat, verwijder de boot en een tang om de zojuist gedroogde aerogels plaatsen in schone glazen scintillatieflesjes. 6. karakteriseren Cyt. C -silica Aerogels met UV-zichtbare en Circulaire dichroïsme (CD) spectroscopie Bereid een kartonnen platform om de aerogel monolieten in de bundel pad van de UV-Visible spectrofotometer of CD spectrometer te houden. Snijd een 2,5 cm x 2,5 cm stuk lichtgewicht karton (zoals karton uit een doos van labotorium weefsel), vouw deze dubbel, gesneden halverwege op de vouw, vouw de twee kleppen, gemaakt door het snijden, rug. Snijd een 5 cm x 5 cm stuk lichtgewicht karton, met een 1,5 cm x 1,5 cm in het vierkant gat in het midden. Gebruik door zwart isolatieband om de grootte van het ruim verminderen tot 0,5 cm x 0,5 cm. Tape de flappen van de gevouwen en gesneden karton tegen de 5 cm x 5 cm stuk karton zodat een kleine gebogen oppervlak wordt gecreëerd voor een aerogel monoliet direct op te zitten voor het 0,5 cm x 0,5 cm gat (zie figuur 2) . Plakt de achterkant stuk karton aan de UV-zichtbare spectrofotometer, zodat het gat is in lijn met de bundel pad. Meet de dikte van de gels, die zal worden gebruikt voor weglengte, met een micrometer. Plaats een gel op het karton platform en meet een spectrum 300-800 nm met lucht in de referentie compartiment van de UV-zichtbare spectrofotometer. Breng een polynoom, A = een </em> λ n, met de golflengte (λ) regio waar de absorptie (A) is voornamelijk te wijten aan de achtergrond verstrooiing, ~ 700-800 nm. De coëfficiënt is typisch geschikt om een getal tussen 1 x 10 ~ 8 en 1 x 10 6 en de n coëfficiënt is typisch geschikt om een getal tussen ~ 2 en 3. Bereken de spreiding bij andere golflengten, waarbij de coëfficiënten a en n, verkregen uit de pasvorm. Trek deze berekende scatter achtergrond absorptie uit het ruwe spectrum om een ​​scatter gecorrigeerd spectrum te verkrijgen. Breng de scatter afgetrokken spectrum met een Gauss-curve in het gebied van 370-490 nm met behulp van geschikte software (GRAM / AI 8,0) aan de piekhoogte, piek centrum en piekbreedte van de Soret piek van de aërogel bepalen. Breng de Wet bier-Lambert met behulp van de gemeten dikte van de gel voor weglengte (l), de extinctiecoëfficiënt 31 (ε) van 106.100 M -1 cm -1 </sup> en de Soret piekhoogte (A) bij de concentratie (C) van cyt. c in de aërogel (A = εlc) berekenen. Vergelijk de berekende cyt. C concentratie de concentratie theoretisch in de gel (15 uM) om de levensvatbaarheid van cyt. C vaststellen binnen de aërogel. Typische procent levensvatbaarheid dicht bij 100%, maar het moet worden opgemerkt dat deze levensvatbaarheid zijn schattingen omdat de berekening gebaseerd op de extinctiecoëfficiënt van cyt. C in oplossing 31 dat verondersteld iets anders dan de extinctiecoëfficiënt van cyt zijn. c in de aerogels die niet bekend is. Run stikstof in de cd-instrument ten minste 5 minuten voordat u de lamp op. Tape de kartonnen houder van de CD spectrometer, zodat het gat is in lijn met de bundel pad. Meet een continue golflengte lege spectrum met niets in de kartonnen houder 350-500 nm bij 100 nm / min, met een gemiddelde van drie scans. Plaats een gel (dikte eerder gemeten in stap 6,2) op het karton platform en meet een spectrum 350-500 nm bij 100 nm / min, met een gemiddelde van drie scans. Herhaal de UV-zichtbare en CD metingen voor alle aerogel monolieten van belang. 7. Detect Aanwezigheid van stikstofoxide (NO) Gas met Cyt. C -silica Aerogels LET OP: Het werken met NO is gevaarlijk en alle NO gas moet in een zuurkast worden behandeld of uitgeput in een zuurkast. Aanhoudende blootstelling aan NO toxisch voor weefsels zeer giftig stikstofdioxide en / of stikstoftetraoxyde zal vormen wanneer NO in contact komt met lucht. Warmte en corrosieve dampen worden ook geproduceerd als NO in contact komt met water. Plaats een 8 L stikstofoxide cilinder (10% stikstofoxide, 90% stikstof) in een goed geventileerde zuurkast en de druk aan te passen tot 4 psi. Verbinding slang aan zowel de stikstofoxide cilinder en een stikstofcilinder (druk ingesteld op 6 psi) en verbinden de uiteinden van de slang aan een T-klep (zie figuur 3a). Kies een aerogel monoliet voor het experiment en meet de dikte (of weglengte) met een micrometer. Plaats de aerogel (~ 3 mm dik) in een wegwerp kuvet met plastic dop en zet de cuvet in de spectrofotometer. Snijd de aerogel eventueel iets te passen in de cuvette. Plaats twee injectienaalden in de plastic dop van de cuvet, een op de uitgang van de T-klep en één verbonden met een buis te dienen als uitlaatgas in de zuurkast (zie figuur 3b). Gebruik Parafilm de naalden af ​​te dichten de buis en de kap aan de cuvet. Plaats een lege disposable cuvet in de referentie cel. Pas de aerogel cuvette standpunt dat de aerogel ligt in de stralengang vóór het begin van het experiment. Neem een ​​eerste spectrum 800-300 nm. Monitor het verschil tussen de absorptie bij 414 nm en de absorptie bij 408 nm liggen terwijl de T-klep te schakelen tussen stikstof en stikstofmonoxide / stikstof mengsel bij ingestelde tijdintervallen ervoor te zorgen dat op geen enkel moment is de stroomsnelheid van stikstof of stikstofoxide / stikstofmengsel zo hoog dat de aerogel beweegt rond in de cuvette. Neem een ​​laatste spectrum 800-300 nm, zodra de blootstelling cycli worden afgewerkt. Herhalen met 03:57 monolieten gemiddeld sensor respons te verkrijgen.