Summary

Eine schnelle und effiziente Methode zur Reinigung von Entodermzellen generiert aus humanen embryonalen Stammzellen

Published: March 03, 2016
doi:

Summary

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Reinigung von differenzierten humanen embryonalen Stammzellen, die in Richtung der endgültigen Endoderm zur Verbesserung der Downstream-Anwendungen und weitere Differenzierungen begangen werden.

Abstract

Die Differenzierung Fähigkeiten von pluripotenten Stammzellen wie embryonale Stammzellen (ES-Zellen) ermöglichen eine mögliche therapeutische Anwendung für Zell-Ersatz-Therapien. Ausdifferenzierten Zelltypen könnten für die Behandlung von verschiedenen degenerativen Krankheiten verwendet werden. In vitro Differenzierung dieser Zellen gegenüber Geweben der Lunge, der Leber und der Bauchspeicheldrüse erfordert als ersten Schritt die Erzeugung von endgültigen endodermalen Zellen. Dieser Schritt ist geschwindigkeitsbestimmend für die weitere Differenzierung zu endständig gereiften Zelltypen, wie beispielsweise Insulin-produzierenden Beta-Zellen, Hepatozyten oder anderen Endoderm-abgeleiteten Zelltypen. Die Zellen, die in Richtung der endoderm Linie verpflichtet sind ausdrücken sehr eine Vielzahl von Transkriptionsfaktoren wie FOXA2, SOX17, HNF1B, die Mitglieder der GATA-Familie, und der Oberflächenrezeptor CXCR4. Allerdings Differenzierungsprotokolle sind selten 100% effizient. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Reinigung eines CXCR4 + Zellpopulation nach der Differenzierungin der DE durch magnetische Mikrokugeln verwendet. Diese Reinigung entfernt zusätzlich Zellen von unerwünschten Linien. Die sanfte Reinigungsverfahren ist schnell und zuverlässig und kann verwendet werden, Downstream-Anwendungen und Differenzierungen zu verbessern.

Introduction

Pluripotente Stammzellen wie embryonale Stammzellen (ES-Zellen) haben die Fähigkeit, in nahezu jedem Zelltyp des menschlichen Körpers zu unterscheiden. Somit können in vitro Differenzierungsprotokollen verwendet werden , um zahlreiche adulten Zelltypen wie Kardiomyozyten 1, Hepatozyten 2, beta – Zellen 3, 4 oder Lungenepithelzellen neuronalen Zellen 5 erzeugen. Dies macht WSR ein wertvolles Werkzeug für die mögliche Behandlung von verschiedenen degenerativen Erkrankungen 3.

Die in vitro Differenzierung von ES- Zellen gegenüber adulten Geweben der Lunge, der Leber und der Bauchspeicheldrüse erfordert eine pseudo-Gastrulation in Zellen erinnert an die definitive Endoderm (DE) 6. Da stromabwärts Differenzierung gegenüber den zuvor erwähnten Arten somatischer Zellen wesentlich weniger effizient ist, wird eine optimale Differenzierung Endoderm gilt als geschwindigkeitsbestimmender 7. Die Zellen, die in Richtung der endoderm Linie begangen werden laufen characteristic Veränderungen in ihrem Genexpressionsprofil. Pluripotenz Master – Regulator – Gene herunterreguliert, während die Expression von anderen Transkriptionsfaktoren wie FOXA2, SOX17, HNF1B, die Mitglieder der GATA – Familie und der Oberflächenrezeptor CXCR4 hoch 6 hochreguliert wird, 8, 9. CXCR4 bekannt durch SMAD2 zu trans / 3, hinter Nodal / TGF-β – Signalisierung und SOX17 aufgrund der spezifischen Bindungsstellen in seiner Promotorregion 10. Somit ist es ein sehr geeignet in einer Reihe von Berichten verwendet Marker 6, 8, 11-13. Diese Expressions Änderungen spiegelt eine Pseudo-gastrulation Ereignis, bei dem WSR erste Merkmale eines primitiven streifenartige Zellpopulation zu erwerben und anschließend begehen in die endoderm Keimschicht 6.

Allerdings sind Differenzierungsprotokolle selten 100% effizient wie wenige Zellen den Differenzierungsprozess widerstehen kann oder Differenzierung gegenüber anderen unbeabsichtigten Linien 14. Diese Zellen können sich negativ auf Influence weitere Differenzierung. Darüber hinaus bergen Rest undifferenzierten Zellen große Risiken für spätere Experimente Transplantation und kann zu teratomas 15-17 geben.

So entfernen Sie können diese unerwünschten Zellen früh auf den Oberflächenmarker CXCR4 zur Reinigung von Zellen verwendet werden , die in Richtung der DE 18 verpflichtet sind. Hier beschreiben wir ein Verfahren für die positive Selektion von CXCR4 + -Zellen aus DE Differenzierungskulturen. Hierzu wird die Oberflächenmarker CXCR4 durch einen Antikörper gebunden, der dann wiederum mit magnetischen Microbeads bindet. Im Gegensatz zu den harten Bedingungen während FACS-Sortierung, die magnetisch markierten DE-ähnlichen Zellen können dann leicht in einem Benchtop-Format gereinigt werden, um eine sanfte Reinigungsverfahren verwendet wird. Dieses Protokoll stellt eine einfache Methode zur Entfernung von Zellpopulationen, die die DE Differenzierungsprozess widerstanden.

Protocol

1. Differenzierung humaner ESC in Richtung Definitive Endoderm Kultivieren humaner embryonaler Stammzellen ( ES- Zellen) in einem Inkubator bei 37 ° C und 5% CO 2. Mantel ein neues 6-Well-Zellkulturplatte mit 1 ml einer Basalmembranmatrix und brüten die Kultur-ware für mindestens 30 min bei RT. Für spezielle Informationen wenden Sie sich an die Anweisungen des jeweiligen Herstellers. Bestätigen Sie, dass die kultivierten menschlichen WSR 80% -90% Konfluenz unter dem Mikrosk…

Representative Results

Bei der Differenzierung WSR laufen drastischen Veränderungen in der Gen und Proteinexpression. Figur 1 typische Markergene darstellt , die verwendet werden können , eine erfolgreiche Endoderm Differenzierung zu verifizieren. Prime Ziele für eine Genexpressionsanalyse sind GSC, FOXA2 und SOX17. In einer relativen Analyse der Genexpression insbesondere FOXA2 und SOX17 erhöht von> 2.000 – fache , wenn si…

Discussion

Derzeit verwendete Differenzierungsprotokolle ergeben sich selten 100% differenzierte Zellen. Aus Gründen, die noch einige Zellen angesprochen werden müssen widerstehen, den Differenzierungsprozess. Abhängig von der Effizienz der verwendeten Differenzierungsprotokoll und die Neigung des ESC Zeile eine bestimmte Anzahl von Rest pluripotenten Zellen häufig beobachtet werden, selbst nach der Differenzierung in die definitive Entoderm. Diese Restzellen können nachgeschaltete Differenzierungen beeinträchtigen oder weit…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die geschickte technische Unterstützung von Jasmin Kresse wird dankbar anerkannt.

Materials

Hues8 human embryonic stem cell line Harvard Department of stem cell & regenerative biology NA Suitable cell line for endoderm generation
Hes3 human embryonic stem cell line ES Cell International NA Suitable and robust cell line for endoderm generation
mTeSR1 Stemcell Technologies 5850 ESC culture medium
FCS Biowest S1860
Advanced RPMI 1640 Life Technologies 12633012
CD184 (CXCR4)-APC, human Miltenyi Biotec 130-098-357
anti-APC MicroBeads Miltenyi Biotec 130-090-855 
OctoMACS Separator Miltenyi Biotec 130-042-109 magnetic field
Y-27632 Selleck Chemicals S1049 ROCK inhibitor
CHIR-99021 Tocris Bioscience 4423
Activin A Peprotech 120-14
Gentle Cell Dissociation Reagent Stemcell Technologies 7174 Enzyme-free passaging solution, alternative: Trypsin/EDTA
Matrigel* Corning 354277 basement membrane matrix
* solve and store in aliquots at -80 °C as outlined in the suppliers manual. Upon use, thaw on ice, dilute in 25 ml ice-cold knockout DMEM/F-12.
Add 1 ml to each well of a 6-well plate and incubate for 45 min at room temperature.
Remove the matrigel and use immediately.
MS Columns Miltenyi Biotec 30-042-201
MACS Separator Miltenyi Biotec 130-042-302
Human FOXA2 FW
gggagcggtgaagatgga
Life Technologies NA
Human FOXA2 REV
tcatgttgctcacggaggagta
Life Technologies NA
Human GSC FW
gaggagaaagtggaggtctggtt
Life Technologies NA
Human GSC REV
ctctgatgaggaccgcttctg
Life Technologies NA
SOX17 TaqMan assay Applied Biosystems Hs00751752_s1
Human SOX7 FW
gatgctgggaaagtcgtggaagg
Life Technologies NA
Human SOX7 REV
tgcgcggccggtacttgtag
Life Technologies NA
Human POU5F1 FW
cttgctgcagaagtgggtggagg
Life Technologies NA
Human POU5F1 REV
ctgcagtgtgggtttcgggca
Life Technologies NA
Human Nanog FW
ccgagggcagacatcatcc
Life Technologies NA
Human Nanog REV
ccatccactgccacatcttct
Life Technologies NA
Human TBP FW
caa cag cct gcc acc tta cgc tc
Life Technologies NA
Human TBP REV
agg ctg tgg ggt cag tcc agt g
Life Technologies NA
Human TUBA1A FW
ggc agt gtt tgt aga ctt gga acc c
Life Technologies NA
Human TUBA1A REV
tgt gat aag ttg ctc agg gtg gaa g
Life Technologies NA
Human G6PD FW
agg ccg tca cca aga aca ttc a
Life Technologies NA
Human G6PD REV
cga tga tgc ggt tcc agc cta t
Life Technologies NA
Anti-SOX2 Santa Cruz Biotechnology sc-17320
Anti-FOXA2 MerckMillipore 07-633
Anti-SOX17 R&D Systems AF1924
NA = not applicable

Referencias

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Citar este artículo
Davenport, C., Diekmann, U., Naujok, O. A Quick and Efficient Method for the Purification of Endoderm Cells Generated from Human Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (109), e53655, doi:10.3791/53655 (2016).

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