CN-GELFrEE - クリア天然ゲル溶出液フラクションエントラップメント電気泳動

細胞内で起こって生物学的プロセスの大部分はタンパク質の集合体ではなく、単一のタンパク質¹によって行われると考えられています。その結果、細胞内のタンパク質サブユニットの特定の生物学的役割を解明するためには、複合体²中の他のタンパク質またはリガンドとのその構造的な相互作用を理解することが必要です。しかし、ネイティブのタンパク質を研究し、その非共有結合性相互作用および活性を維持する、困難なままです。天然タンパク質の研究の欠点の一つは、様々な下流のタンパク質解析技術と互換性のある適切な天然の分離技術です。そのため、生体分子の非共有結合アセンブリを特徴付けることが可能な分離技術の最近の関心が急激に³に増加しています。

タンパク質分離技術は、生化学、生物物理学および種々の他の研究に不可欠です。現在のネイティブ分離技術はintrinsiを持っていますこのような低解像度、低スループット、降水量の損失、および初期試料の大量の要件として下流の分析、との互換性を減らすCの欠乏。タンデムアフィニティー精製は、一般に、タンパク質相互作用の研究のために使用されるが、それはハイスループット分析⁴と互換性があることが原因と、各タンパク質標的に対して別々に行わなければなりません。サイズ排除クロマトグラフィー^5、全てが天然の分離を提供するが、本質的に低解像度化技術であり、高い初期サンプル量を必要としているイオンアフィニティークロマトグラフィー⁵及び密度勾配分離⁶と選択的沈殿。

あるいは、ブルーネイティブ（BN）及びクリアネイティブ（CN）PAGE（1-Dのいずれかまたは2-D）のようなゲルベースの​​技術は、高分解能の分離を示します。また、上記の他の技術とは対照的、両方のネイティブPAGE分離は、溶解性と幅広いRの天然のコンフォメーションを維持します疎水性タンパク質を含む巨大分子種のアンジュ。この機能は、さらに、これらの方法^7,8が到達したプロテオームカバレッジを拡大し、CNおよびBN-PAGEの間で異なる化学的性質により達成されます。 CN-PAGEは、一般的にBN-PAGEでクーマシーブルー色素を交換し、キャリア分子としてソフトの荷電界面活性剤に依存しています。より高解像度に関連付けられているものの、BN-PAGEは、このような分離されたタンパク質⁸およびクマシー分子付加体形成における減少した酵素活性、後者の下流MSに大幅に不利である^9を分析^するなどの注意点があります。両方のこれらの方法は、しかしながら、伝統による染色およびゲル抽出の制限⁷に低い回収率および狭いプロテオームカバー率と関連しています。

変性したタンパク質の研究のために、高タンパク質回収率で高解像度の分別を行いながら、高分子の溶解性を維持し、それをdと互換性のあるいくつかの技術があります分離後、タンパク質分析技術をiverse。ゲル溶出液フラクションエントラップメント電気泳動（GELFrEE）は、すべてのこれらの特性に合わせ分別技術の一つです。この方法は、主に、それが迅速かつ汎用性であることを示し、ハイスループットトップダウンプロテオミクス研究に適用されます。 GELFrEEでは、タンパク質は変性され、管状のゲルマトリックスを介して、分子量に基づく分離の気孔率は、サンプルの要件および所望の分別結果に基づいて変更することができます。画分は、このように、高解像度を維持しながら、SDS-PAGEに関連付けられた回復の制約を低減する、液相で溶出します。画分のアリコートを、次いで、分子量帯域幅の選択¹¹のための1次元PAGEによって分析することができます。ネイティブの分離技術でGELFrEEに関連する利点に対する高い需要があります。本明細書に記載の方法は、クリアネイティブGELFrEE（CN-GELFrEE）は、GELFrEEのネイティブ適応したものです。広幅sとの互換性を保つために、それらの天然の状態で巨大分子のpectrum、この方法は、ソフトCN-PAGE化学に関するだけでなく、不連続なゲル系⁹に存在する気孔率との間に過酷な遷移を排除することにより、タンパク質沈殿を低減し、気孔率勾配分離、上だけでなく、依存しています。マウスの心臓から抽出したタンパク質複合体を分画するために適用した場合、溶出画分は、高い回収率を表示し、広範囲の分子量の高分解能分離が得られました。さらに、得られた画分は、最下流の生化学的と互換性があり、生物物理学的タンパク質が分析します。