CN-GELFrEE - Clear natif Gel-élué Fraction liquide Entrapment Electrophoresis

La plupart des processus biologiques qui se déroulent à l' intérieur d' une cellule sont considérées comme étant réalisées par des assemblages de protéines plutôt que des protéines individuelles ^1. Par conséquent, afin d'élucider le rôle biologique spécifique d'une sous – unité de la protéine dans une cellule , il est nécessaire de comprendre ses interactions avec d' autres protéines structurales ou des ligands dans les complexes ^2. Cependant, l'étude des protéines nativement, le maintien de leurs interactions et de l'activité non-covalentes, reste difficile. L'un des défauts des études de la protéine native est une technique de séparation natif approprié qui est compatible avec les différentes techniques d'analyse des protéines en aval. Par conséquent, l' intérêt récent des techniques de séparation permettant de caractériser des ensembles non-covalentes de biomolécules a fortement augmenté ^3.

Les techniques de séparation des protéines sont indispensables à la biochimie, la biophysique et de diverses autres études. Les techniques de séparation natives actuelles ont intrinsidéficiences c qui réduisent la compatibilité avec les analyses en aval, tels que la faible résolution, un faible débit, la perte de la précipitation, et l'exigence de grandes quantités d'échantillon initial. Tandem purification d'affinité est couramment utilisé pour les études d'interaction des protéines, mais il doit être effectué séparément pour chaque protéine cible, l' amenant à être incompatible avec l' analyse à haut débit ^4. Chromatographie d'exclusion de taille ^5, la précipitation sélective avec une Chromatographie d'affinité d'ions et ⁵ gradient de densité de séparation ⁶ ont tous fourni des séparations natives, mais sont en soi des techniques à basse résolution et nécessitent des quantités initiales élevées de l' échantillon.

En variante, des techniques à base de gel, comme le bleu natif (BN) et Clear natif (CN) PAGE (soit 1-D ou 2-D), écran haute résolution séparation. En outre, ce qui contraste avec les autres techniques mentionnées, les deux séparations PAGE indigènes maintiennent la solubilité et conformation native d'un large range d'espèces macromoléculaires, y compris des protéines hydrophobes. Cette capacité élargit encore la couverture du protéome atteint par ces méthodes ^7,8 et est réalisée grâce à la chimie différente entre le CN et BN-PAGE. CN-PAGE repose généralement sur les détergents doux chargés comme des molécules porteuses, en remplaçant le colorant bleu de Coomassie dans BN-PAGE. BN-PAGE, mais associée à une résolution plus élevée, telles que des mises en garde a une activité enzymatique réduite dans les protéines séparées ⁸ et formation d' un produit d' addition d' une molécule de Coomassie, ce dernier étant fortement préjudiciable à l' aval des analyses MS ^9. Ces deux méthodes, cependant, sont traditionnellement associés à une faible récupération et de la couverture du protéome étroite en raison de la coloration et les limites d'extraction de gel ^7.

Pour l'étude des protéines dénaturées, il existe plusieurs techniques qui maintiennent macromolécule solubilité dans l'exercice de haute résolution fractionnement avec récupération riche en protéines et qui sont compatibles avec diVerse techniques d'analyse de protéines post-séparation. Gel-éluée Fraction liquide Entrapment Electrophoresis (GELFrEE) est l'une des techniques de fractionnement qui correspondent à toutes ces caractéristiques. Cette méthode est largement appliquée dans les études à haut débit protéomique haut de bas, ce qui indique qu'il est rapide et polyvalent. En GELFrEE, les protéines sont dénaturées et séparés en fonction du poids moléculaire à travers une matrice de gel tubulaire, dont la porosité peut varier en fonction des exigences de l'échantillon et les résultats de fractionnement souhaités. Les fractions sont éluées en phase liquide, en réduisant ainsi les limitations de récupération associés à la SDS-PAGE, tout en conservant une grande résolution. Aliquotes de fractions peuvent ensuite être analysés par 1-D PAGE pour poids moléculaire sélection de bande passante ^11. Il y a une forte demande pour les avantages associés à GELFrEE dans les techniques de séparation indigènes. Le procédé décrit ici, Effacer natif GELFrEE (CN-GELFrEE), est une adaptation native de GELFrEE. Afin d'être compatible avec une large spectrum des macromolécules dans leur état ​​natif, ce procédé repose non seulement sur ​​la NC-PAGE chimie douce, mais également une séparation par gradient de porosité, ce qui réduit la précipitation des protéines en éliminant la transition dure entre les porosités présentes dans les systèmes de gels discontinus ^9. Lorsqu'il est appliqué à fractionner les complexes de protéines extraites du coeur de la souris, les fractions éluées affichent une récupération élevée et une séparation à haute résolution d'une large gamme de poids moléculaires a été obtenue. En outre, les fractions obtenues sont compatibles avec la plupart des analyses de protéines biochimique et biophysique en aval.