CN-GELFrEE - واضح الأصلية جل مزال-جزء السائل الفخ الكهربائي
Summary
This protocol describes how to prepare and perform clear native gel-eluted liquid fraction entrapment electrophoresis (CN-GELFrEE), a native separation technique for non-covalent biomolecular assemblies and proteins from heterogeneous samples that is compatible with various downstream protein analysis techniques.
Abstract
مجمعات البروتين أداء مجموعة من الوظائف الخلوية حاسمة. توضيح التفاعلات والديناميات غير التساهمية من الأهمية بمكان لفهم دور المجمعات في النظم البيولوجية. في حين أن توصيف المباشر من التجمعات الجزيئية البيولوجية أصبحت ذات أهمية متزايدة في السنوات الأخيرة، وتقنيات تجزئة الأم التي تتوافق مع تقنيات تحليل المصب، بما في ذلك قياس الطيف الكتلي والتي تكون ضرورية لتوسيع هذه الدراسات. ومع ذلك، فإن المجال يفتقر إلى الإنتاجية العالية، مجموعة واسعة، وارتفاع انتعاش طريقة فصل للجمعيات البروتين الأم. هنا، نقدم اضح أصلي مزال هلام السائل جزء انحباس الكهربائي (CN-GELFrEE)، وهي طريقة فصل جديدة لالمجالس بروتين غير التساهمية. وقد تجلى أداء الفصل CN-GELFrEE من المجمعات تجزئة المستخرجة من قلب فأر. تم جمع الكسور أكثر من 2 ساعة وعرض أشرطة منفصلة تتراوح بين ~ 30-500 كيلو دالتون. ويخدعوقد لوحظ نمط sistent زيادة عرض النطاق الترددي الوزن الجزيئي، كل بدءا ~ 100 كيلو دالتون. وعلاوة على ذلك، أظهرت إعادة تحليل لاحق من كسور الأم عبر SDS-PAGE الوزن الجزيئي التحولات يتفق مع تمسخ من المجمعات البروتين. لذلك، وقد ثبت CN-GELFrEE إلى توفر القدرة على أداء عالية الدقة وعالية انتعاش فصل الأم عن مجمعات البروتين من مجموعة كبيرة الوزن الجزيئي، وتوفير الكسور التي تتوافق مع ويحلل البروتين المصب.
Introduction
ويعتقد غالبية العمليات البيولوجية يحدث داخل الخلية التي يتعين الاضطلاع بها من قبل المجالس البروتين بدلا من البروتينات واحدة 1. ونتيجة لذلك، من أجل توضيح دور حيوي معين من وحدة فرعية من البروتين في الخلية لا بد من فهم التفاعلات البنيوية مع البروتينات أو بروابط أخرى في المجمعات 2. ومع ذلك، ودراسة البروتينات أصلا، والحفاظ على تفاعلاتها غير التساهمية والنشاط، لا يزال تحديا. واحد من أوجه القصور في الدراسات البروتين الأم هي تقنية فصل الأم المناسبة التي تتوافق مع مختلف تقنيات تحليل البروتين المصب. لذلك، ازداد الاهتمام مؤخرا في تقنيات الفصل قادرة على تميز المجالس غير التساهمية الجزيئات الحيوية بشكل حاد 3.
تقنيات فصل البروتين أمر لا بد منه لوالكيمياء الحيوية والفيزياء الحيوية وغيرها من الدراسات المختلفة. تقنيات الفصل الأم الحالية لها intrinsiأوجه القصور ج التي تقلل من التوافق مع التحليلات المصب، مثل دقة منخفضة، وانخفاض الإنتاجية، وفقدان لهطول الأمطار، وشرط كميات كبيرة من عينة أولية. يستخدم تنقية تقارب جنبا إلى جنب عادة للدراسات التفاعل البروتين، ولكن لا بد من تنفيذها بشكل منفصل لكل هدف من البروتين، الامر الذي ادى الى تكون غير متوافقة مع تحليل الإنتاجية العالية 4. استبعاد حجم اللوني 5، هطول انتقائية مع أيون تقارب اللوني 5 وكثافة التدرج الفصل 6 وفرت كل فصل الأم، ولكن هي بطبيعتها تقنيات منخفضة الدقة وتتطلب عالية كميات عينة أولية.
بدلا من ذلك، التقنيات المعتمدة هلام، مثل الأزرق الأصلية (الجبهة الوطنية) واضح الأصلية (CN) PAGE (إما 1-D أو 2-D)، عرض عالية الدقة الانفصال. وعلاوة على ذلك، المتناقضة مع غيرها من التقنيات المذكورة، على حد سواء فصل PAGE الأم الحفاظ على الذوبان والتشكل الأصلي لص اسعانجى الأنواع جزيء، بما في ذلك البروتينات مسعور. يوسع هذه القدرة كذلك تغطية بروتيوم التي توصلت إليها هذه الأساليب 7،8 ويتحقق من خلال الكيمياء مختلفة بين CN وBN-PAGE. CN-PAGE تعتمد عادة على المنظفات اتهم لينة مثل جزيئات الناقل، لتحل محل صبغ Coomassie الأزرق في BN-PAGE. BN-PAGE، على الرغم من أن يرتبط مع دقة أعلى، له محاذير مثل انخفاض النشاط الأنزيمي في البروتينات فصل 8 و تشكيل ناتج إضافة Coomassie الجزيء، وهذا الأخير هو يمس بشكل كبير في مرض التصلب العصبي المتعدد المصب يحلل 9. كل من هذه الطرق، ومع ذلك، وترتبط تقليديا مع بطء انتعاش وتغطية بروتيوم ضيقة بسبب تلطيخ والقيود استخراج الهلام 7.
لدراسة البروتينات التشويه والتحريف، وهناك العديد من التقنيات التي تحافظ على جزيء الذوبان أثناء أداء عالية الدقة تجزئة مع استعادة نسبة عالية من البروتين والتي تكون متوافقة مع دiverse تقنيات تحليل البروتين في مرحلة ما بعد الانفصال. هلام مزال السائل جزء الفخ الكهربائي (GELFrEE) هي واحدة من أساليب التجزئة التي تتلاءم مع كل هذه الخصائص. يتم تطبيق هذا الأسلوب إلى حد كبير في دراسات البروتينات من أعلى إلى أسفل عالية الإنتاجية، مشيرا إلى أنه سريع وتنوعا. في GELFrEE والبروتينات هي التشويه والتحريف ومنعزلة على أساس الوزن الجزيئي من خلال مصفوفة هلام أنبوبي، والمسامية والتي يمكن أن تختلف على أساس متطلبات العينات ونتائج تجزئة المطلوب. ومزال كسور في الطور السائل، وبالتالي تقليل القيود الانتعاش المرتبطة SDS-PAGE مع الحفاظ على دقة عالية. ومن ثم يمكن تحليلها قسامات جزء من 1-D PAGE عن الوزن الجزيئي اختيار عرض النطاق الترددي 11. وهناك طلب كبير على المزايا المرتبطة GELFrEE في تقنيات الفصل الأم. الطريقة الموصوفة هنا، واضح الأصلية GELFrEE (CN-GELFrEE)، هو التكيف الأصلي من GELFrEE. من أجل أن تكون متوافقة مع الصورة واسعpectrum من الجزيئات في دولتهم الأم، ويعتمد هذا الأسلوب ليس فقط على لينة الكيمياء CN-PAGE، ولكن أيضا على الفصل المسامية الانحدار، مما يقلل من هطول الأمطار البروتين من خلال القضاء على انتقال قاسية بين مسام موجودة في أنظمة هلام متقطعة 9. عندما يطبق على يجزئ مجمعات البروتين المستخرج من قلب فأر، عرض كسور مزال استرداد عالية وفصل عالية الدقة من مجموعة واسعة من الأوزان الجزيئية تم الحصول عليها. وعلاوة على ذلك، الكسور الناتجة متوافقة مع معظم التحليلات المصب البروتين والكيمياء الحيوية والفيزياء الحيوية.
Protocol
Representative Results
Discussion
مشتق CN-GELFrEE من مواليد واضح (CN) PAGE نظام المخزن الذي يستخدم خليط من أنيونية والمنظفات محايدة كما جزيئات الناقل 9 لتجزئة البروتين على أساس الوزن الجزيئي من خلال مصفوفة هلام. تطبيق CN-GELFrEE إلى الأصلي الماوس القلب استخراج البروتين ولدت كسور تعقيد منخفضة مع عرض نطاق ترد?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
قدمت مؤسسة WM كيك بسخاء التمويل لهذا العمل. وتستند هذه المواد على العمل بدعم من FAPERJ منحة بحثية 100.039 / 2014 من حكومة ريو دي جانيرو الدولة – البرازيل لالمبثوثة، علوم بلا حدود منحة دراسية 88٬888،075416 / 2013-00 من التنسيق لتحسين لموظفي التعليم العالي، في ظل الحكومة من البرازيل، لدعم الخدمات الصحية ومؤسسة العلوم العليا زمالة القومي للبحوث تحت الزمالة رقم 2014171659 لمرصد الصحراء والساحل، وCNPq البحوث منحة 202011 / 2012-7 من حكومة البرازيل لLHFDVPCH هي المستفيدة من الكيمياء في جامعة نورث وسترن للحياة العمليات معهد ما بعد الدكتوراه جائزة الزمالة.
Materials
| Reagents | |||
| 30% acrylamide/bis solution, 37.5:1 | Bio-Rad | 161-0158 | This solution is neurotoxic. |
| 6-aminohexanoic acid (ε-aminocaproic acid) | Sigma-Aldrich | A2504 | This chemical is an irritant. |
| Ammonium persulfate (APS) | Fisher Scientific | 7727-54-0 | This chemical is flammable, toxic, and corrosive. |
| Coomassie blue G250 | Bio-Rad | 161-0406 | |
| Dodecylmaltoside | Sigma-Aldrich | D4641 | This chemical is an irritant. |
| Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) | FLUKA | 3777 | This chemical is toxic. |
| Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | BP120 | This chemical is toxic. |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| Liquid nitrogen | Any supplier | n/a | Store liquid nitrogen in containers designed for low-temperature liquids |
| Mouse heart | Bioreclamation LLC | MSE-HEART | |
| n-butanol | Fisher Scientific | 71-36-3 | This chemical is flammable and toxic. |
| Ponceau S | Sigma-Aldrich | BP103 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Thermo Fisher Scientific | 78430 | This chemical is toxic. |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | This chemical is an irritant. |
| Sucrose | JTBaker | 4097 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Bio-Rad | 161-0800 | This chemical flammable and irritant. |
| Tris-HCl | Amresco | M151 | |
| Trycine | Bio-Rad | 161-071 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Gradient mixer | Hoefer | SG15 | |
| Magnetic stir | Any supplier | n/a | |
| Magnetic bars | Any supplier | n/a | Small enough to fit inside the gradiet mixer chambers. |
| Power supply | Bio-Rad | 164-5056 | Voltage up to 1,500 V |
| Refrigerated centrifugue | Eppendorf | 022622552 | Up to 15,000 x g |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| 15 mL conical tube | Any supplier | n/a | |
| 30-kDa-MWCO ultra centrifugal filter | Millipore | UFC503096 | |
| Flexible tubing | Saint-Gobain | B000FOV1J0 | Approximately 1 m length |
| Ice bucket | Any supplier | n/a | |
| Liquid/air metallic or plastic valve. (e.g. aquarium air/water flow control lever valve) | Any supplier | n/a | Aquarium valves are compatible. |
| Mortar and pestle | Any supplier | n/a | |
| Native PAGE 3-12% T slab gel | Invitrogen | BN1003 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| Petri dish | Fisher Scientific | 08-757-13 | |
| Protein low bind tube 1.5 mL | Eppendorf | 022431081 | |
| Razor blade | IDL Tools | TE05-091C | |
| Regenerated cellulose dialysis tubing 3,500 MWCO | Fisher Scientific | 21-152-9 | |
| SDS-PAGE slab gel for any kDa | Bio-Rad | 456-9036 | |
| Serological pipets (25 ml) | VWR | 89130-900 | |
| Syringe (10 ml) | Any supplier | n/a | |
Referencias
- Alberts, B. The Cell as a Collection of Protein Machines: Preparing the Next Generation of Molecular Biologists. Cell. 92 (3), 291-294 (1998).
- Gingras, A. C., Gstaiger, M., Raught, B., Aebersold, R. Analysis of protein complexes using mass spectrometry. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8 (8), 645-654 (2007).
- Gavin, A. C., Bösche, M., et al. Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. Nature. 415 (6868), 141-147 (2002).
- Puig, O., Caspary, F., et al. The Tandem Affinity Purification (TAP) Method: A General Procedure of Protein Complex Purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
- Cremer, K. D., Hulle, M. V., et al. Fractionation of vanadium complexes in serum, packed cells and tissues of Wistar rats by means of gel filtration and anion-exchange chromatography. JBIC J. Biol. Inorg. Chem. 7 (7-8), 884-890 (2002).
- Tanese, N. Small-Scale Density Gradient Sedimentation to Separate and Analyze Multiprotein Complexes. Methods. 12 (3), 224-234 (1997).
- Bunai, K., Yamane, K. Effectiveness and limitation of two-dimensional gel electrophoresis in bacterial membrane protein proteomics and perspectives. J. Chromatogr. B. 815 (1-2), 227-236 (2005).
- Wittig, I., Schägger, H. Advantages and limitations of clear-native PAGE. PROTEOMICS. 5 (17), 4338-4346 (2005).
- Skinner, O. S., Do Vale, L. H. F., et al. Native GELFrEE: A New Separation Technique for Biomolecular Assemblies. Anal. Chem. 87 (5), 3032-3038 (2015).
- Nijtmans, L. G. J., Henderson, N. S., Holt, I. J. Blue Native electrophoresis to study mitochondrial and other protein complexes. Methods. 26 (4), 327-334 (2002).
- Tran, J. C., Doucette, A. A. Gel-Eluted Liquid Fraction Entrapment Electrophoresis: An Electrophoretic Method for Broad Molecular Weight Range Proteome Separation. Anal. Chem. 80 (5), 1568-1573 (2008).
- Smith, P. K., Krohn, R. I., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).
