Summary

Simultânea de dois fótons<em> In Vivo</em> Imagem de Synaptic Entradas e metas pós-sinápticos no córtex do rato retrospl�ico

Published: March 13, 2016
doi:

Summary

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in mouse retrosplenial cortex using in vivo two photon microscopy in Thy1-GFP transgenic line. This approach is combined with injection of mCherry-expressing adeno-associated virus into dorsal hippocampus. These techniques allow long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Abstract

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon microscopy in Thy1-GFP transgenic mouse line. This approach creates a possibility to investigate the correlation of behavioural manipulations with changes in neuronal morphology in vivo.

The cranial window implantation procedure was considered to be limited only to the easily accessible cortex regions such as the barrel field. Our approach allows visualization of neurons in the highly vascularized RSC. RSC is an important element of the brain circuit responsible for spatial memory, previously deemed to be problematic for in vivo two-photon imaging.

The cranial window implantation over the RSC is combined with an injection of mCherry-expressing recombinant adeno-associated virus (rAAVmCherry) into the dorsal hippocampus. The expressed mCherry spreads out to axonal projections from the hippocampus to RSC, enabling the visualization of changes in both presynaptic axonal boutons and postsynaptic dendritic spines in the cortex.

This technique allows long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Introduction

microscopia de dois fótons revolucionou a observação de atividade cerebral em viver e se comportar animais. Desde a sua introdução, em 1990, rapidamente ganhou popularidade e agora é implementado como uma das abordagens mais interessantes e inovadores no sentido de exame dos vários aspectos da atividade do cérebro in vivo 1,2. Estas aplicações incluem medições de fluxo de sangue, ativação neuronal (por exemplo, usando indicadores de nível de cálcio ou genes precoces imediatos de expressão) e a morfologia das células neuronais. Um número crescente de laboratórios usam microscópios de dois fótons, implementando a técnica em todo o mundo científico como um novo padrão para in vivo de imagens do cérebro.

A abordagem padrão envolve o implante da janela cranial (um buraco redondo no crânio coberto com uma tampa de vidro) sobre o tambor ou córtex visual do cérebro do rato 3. Em seguida, dependendo do protocolo experimental, o mouse sofre uma série de visualização e sessões de treinamento comportamental, permitindo monitorar as mudanças na atividade cerebral e morfologia neuronal ao longo do tempo 4,5. Em ambos os casos, a craniotomia só afecta o osso parietal, sem atravessar as suturas. Acredita-se largamente que a principal desvantagem da técnica é a sua aplicação limitada a córtices facilmente acessíveis, tais como o barril ou córtex visual. Implantação da janela craniana sobre outras regiões levanta uma série de dificuldades, devido a hemorragia excessiva e / ou impedimento espacial.

Neste trabalho, propomos a implantação da janela do crânio acima do córtex retrospl�ico (RSC) como outra possível região de interesse para dois fótons em microscopia vivo 6. RSC é um elemento importante do circuito do cérebro responsável pela formação da memória espacial. Anatomicamente, CER é uma parte de uma rede neuronal cortical de ligação, do hipocampo, do tálamo e as regiões 7. Isto éfortemente envolvido em uma série de comportamentos, tais como a aprendizagem e extinção espacial, bem como navegação espacial 6.

Para visualizar as alterações morfológicas dos neurônios usamos uma linha de rato transgénico expressando a proteína fluorescente verde (GFP) sob o promotor Thy1. Nestes ratos, GFP é expressa em aproximadamente 10% dos neurônios no cérebro que permitem a visualização clara dos axônios e dendritos corticais por meio de microscopia de dois fótons 8. Uma outra inovação que propomos consiste na injecção de um adeno-associado recombinante de vírus de serotipo 2/1 (rAAV2 / 1) que codifica uma proteína fluorescente vermelha (mCherry) sob um promotor específico de neurónios CaMKII 9 nas estruturas mais profundas do cérebro que se projectam para RSC , tal como o hipocampo. A expressão de rAAV2 / 1 mCherry no hipocampo de rato Thy1-GFP permite a visualização simultânea de elementos pré- e pós-sinápticos do Hippocampo-Cortical sinapses 10. A expressão de rAAV-driven de mCherry requer duas a três semanas para a proteína para alcançar um nível suficiente nos terminais axonais. Este período é consistente com o tempo habitual necessário para a recuperação de craniotomia.

Protocol

Todos os procedimentos experimentais descritos abaixo foram aprovados pelo Comitê de Ética local no Instituto Nencki of Experimental Biology, da Academia Polonesa de Ciências. Nota: Algumas das cenas do vídeo associado são acelerados. fator de velocidade é indicado nestas cenas. 1. Cirurgia Preparação Esterilizar todas as ferramentas, recipientes de vidro para líquidos e cotonetes na autoclave. Use luvas dispensáveis. Limpar a mesa cirúrgica…

Representative Results

A expressão de GFP em um subconjunto de neurónios no ratinho repórter Thy1-GFP permite a imagem in vivo dos dendritos corticais e projecções axonais locais no RSC. A Figura 1A mostra a projecção máxima de uma pilha de imagens múltiplas com dendrites GFP positivas visíveis. O corpo da célula é obscurecida por uma artéria. A Figura 1B mostra uma imagem ampliada único plano (zoom digital de 3x) do ramo dendríticas indicado no 1A. Det…

Discussion

No presente trabalho apresentamos um protocolo para a utilização simultânea de dois fótons de imagem in vivo das entradas sinápticas e metas pós-sinápticos em RSC através de uma janela craniana. O procedimento de implantação consistem em vários passos-chave. Em primeiro lugar, o animal é anestesiado profundamente e fixada na moldura estereotáxica, em seguida, o crânio sobre RSC é diluído com uma broca ao longo das linhas circulares marcados e o osso circular é removido. Após a hemorragia é pa…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores gostariam de agradecer a M. Steczkowski para gravações de voz, M. Borczyk para desenhos, A. Trąbczyńska para a produção de vírus, M. Ziókowska para genotipagem e A. Mirgos de assistência com as filmagens. KR reconhece o presente tipo do vírus adeno-associado recombinante (rAAV) que expressam a proteína fluorescente mCherry sob o controlo do promotor de CaMK K. Deisseroth. Este projeto foi realizado nas instalações centrais do Laboratório de modelos animais e Laboratório de Estrutura do tecido e função, Centro de Neurobiologia, Nencki Instituto de Biologia Experimental, com a utilização da infra-estrutura da CEPT, financiado pela União Europeia – Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional no âmbito do Programa Operacional "Economia inovadora" para o período 2007-2013. Este trabalho foi apoiado por subsídios da National Science Centre: Sonata Bis 2012/05 / E / NZ4 / 02.996, Harmonia 2013/08 / M / NZ3 / 00861, Symfonia 2013/08 / W / NZ24 / 00691 para KR e Sonata Bis 2014 / 14 / E / NZ4 / 00172 a RC

Materials

Drug
Isoflurane Baxter AErrane 8DG9623 5-2% pre-operative
Isoflurane Baxter AErrane 8DG9623 1.5-2% during surgery
Dexametasone Scan Vet Dexasone 2mg/ml 0.2 mg/kg intramuscular
Baytril Bayer 2.50% 5 mg/kg subcutaneously
Tolfedine Vetoquinol 4% 4 mg/kg subcutaneously
Butomidor Richter Pharma 10 mg/ml 2 mg/kg subcutaneously
Carprofen KRKA-Polska Rycarfa 50mg/ml 10 mg/kg subcutaneously
Lidocaine Jelfa Lignocainum topically
Lidocaine Jelfa 20 mg/g topically
Surgery
Gelfoam Ethicon Spongostan dental; REF MS0005
Eye ointment Dedra Lubrithal topically
CA glue Pelikan Daniel 20G Huste
Dental acrylic SpofaDental Duracryl Plus
Stereotaxic frame Stoelting 51500D
Tool
Coverglass Harvard Apparatus HSE-64-0720 3 mm diameter
Dental drill Sigmed Keystone KVet
Fixation bar Custom made N/A M2 or M3 screw nuts could be used
Forceps Renex PN-7B-SA
Micro scissors Falcon BM.183.180
Dissection microscope KOZO XTL6445T
Imaging
Holder frame Custom made N/A
Two-photon microscope Zeiss Upright Axio Examiner Z1 Laser unit: Coherent Chameleon 690-1040nm with Optical Parametric Oscillator 1050-1300nm. Objectives: EC-PLAN-NEUFLUAR 10x/0.1 and LD Plan-APOCHROMAT 20x/1.0. Detection: Zeiss bandpass filters BP 500-550 (GFP) and BP 570-610 (mCherry) separated by beam splitter at 560nm and coupled to two GaAsP photodetectors. 
Reagent
Virus gift from K. Deisseroth Recombinant adeno-associated virus (rAAV) expressing fluorescent protein mCherry under the control of CaMK promoter

Referencias

  1. Grutzendler, J., Gan, W. B. Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain. NeuroRx. 3, 489-496 (2006).
  2. Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
  3. Trachtenberg, J. T., et al. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420, 788-794 (2002).
  4. Holtmaat, A., et al. Imaging neocortical neurons through a chronic cranial window. Cold Spring Harb Protoc. 2012, 694-701 (2012).
  5. Chow, D. K., et al. Laminar and compartmental regulation of dendritic growth in mature cortex. Nat Neurosci. 12, 116-118 (2009).
  6. Czajkowski, R., et al. Encoding and storage of spatial information in the retrosplenial cortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 8661-8666 (2014).
  7. Czajkowski, R., et al. Superficially projecting principal neurons in layer V of medial entorhinal cortex in the rat receive excitatory retrosplenial input. J Neurosci. 33, 15779-15792 (2013).
  8. Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
  9. Couey, J. J., et al. Recurrent inhibitory circuitry as a mechanism for grid formation. Nat Neurosci. 16, 318-324 (2013).
  10. Miyashita, T., Rockland, K. S. GABAergic projections from the hippocampus to the retrosplenial cortex in the rat. European Journal of Neuroscience. 26, 1193-1204 (2007).

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Citar este artículo
Łukasiewicz, K., Robacha, M., Bożycki, Ł., Radwanska, K., Czajkowski, R. Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex. J. Vis. Exp. (109), e53528, doi:10.3791/53528 (2016).

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