Simultane twee-foton<em> In Vivo</em> Beeldvorming van Synaptic In- en Postsynaptische Doelen op Mouse retrospleniale Cortex
Summary
This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in mouse retrosplenial cortex using in vivo two photon microscopy in Thy1-GFP transgenic line. This approach is combined with injection of mCherry-expressing adeno-associated virus into dorsal hippocampus. These techniques allow long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.
Abstract
This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon microscopy in Thy1-GFP transgenic mouse line. This approach creates a possibility to investigate the correlation of behavioural manipulations with changes in neuronal morphology in vivo.
The cranial window implantation procedure was considered to be limited only to the easily accessible cortex regions such as the barrel field. Our approach allows visualization of neurons in the highly vascularized RSC. RSC is an important element of the brain circuit responsible for spatial memory, previously deemed to be problematic for in vivo two-photon imaging.
The cranial window implantation over the RSC is combined with an injection of mCherry-expressing recombinant adeno-associated virus (rAAVmCherry) into the dorsal hippocampus. The expressed mCherry spreads out to axonal projections from the hippocampus to RSC, enabling the visualization of changes in both presynaptic axonal boutons and postsynaptic dendritic spines in the cortex.
This technique allows long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.
Introduction
Twee-foton microscopie een revolutie in de observatie van de hersenactiviteit in levende en gedragen dieren. Sinds de introductie in 1990 al snel aan populariteit gewonnen en wordt nu geïmplementeerd als een van de meest interessante en innovatieve benaderingen in de richting van het onderzoek van een groot aantal aspecten van de hersenactiviteit in vivo 1,2. Deze toepassingen omvatten metingen van de bloedstroming, neuronale activering (bijvoorbeeld met behulp van calcium niveau-indicatoren of onmiddellijke vroege genen expressie) en de morfologie van neuronale cellen. Steeds laboratoria twee-foton microscopen, waarmee de techniek gehele wetenschap als een nieuwe standaard voor in vivo beeldvorming van de hersenen.
De standaard aanpak omvat de implantatie van het craniale venster (een rond gat in de schedel bedekt met een deksel glas) over het vat of de visuele cortex van de hersenen van muizen 3. Volgende, afhankelijk van de experimentele protocol, het mouse ondergaat een reeks visualisatie en gedragsmatige trainingen, zodat de veranderingen in de hersenactiviteit en neuronale morfologie tijd 4,5 volgen. In beide gevallen craniotomie alleen invloed op de pariëtale botten, zonder over de hechtingen. Het is grotendeels aangenomen dat de belangrijkste nadeel van deze techniek is de beperkte toepassing er eenvoudig cortex als het vat of visuele cortex. Implantatie van het craniale raam over andere gebieden vormt veel moeilijkheden vanwege overmatig bloeden en / of ruimtelijke belemmering.
In dit artikel stellen we de inplanting van de craniale raam boven de retrospleniale cortex (RSC) als een andere mogelijke regio van belang voor twee-foton in vivo microscopie 6. RSC is een belangrijk onderdeel van de hersenen circuit verantwoordelijk voor ruimtelijke geheugenvorming. Anatomisch, RSC is een onderdeel van een neuronaal netwerk tussen corticale, hippocampus en thalamus regio's 7. Het issterk betrokken bij een reeks van gedrag, zoals ruimtelijke leren en uitsterven, evenals ruimtelijke navigatie 6.
Om de morfologische veranderingen van de neuronen te visualiseren gebruiken we een transgene muis tot expressie groen fluorescerend eiwit (GFP) onder de thy1 promoter. In deze muizen wordt GFP tot expressie gebracht in ongeveer 10% van de neuronen in de hersenen waardoor duidelijke visualisatie van de corticale axons en dendrieten behulp van twee-foton microscopie 8. Een andere innovatie die we voorstellen is de injectie van een recombinant adeno-geassocieerd virus serotype 2/1 (rAAV2 / 1) codeert een rood fluorescerend eiwit (mCherry) onder een neuron-specifieke promoter 9 CaMKII in de diepere structuren van de hersenen projecteert RSC zoals de hippocampus. De expressie van rAAV2 / 1 mCherry in de hippocampus van Thy1-GFP muis maakt gelijktijdige visualisatie van pre- en postsynaptische elementen van de Hippocampo-Cortical synapsen 10. De rAAV-gestuurde expressie van mCherry vereist twee tot drie weken voor het eiwit voldoende niveau te bereiken in het axonale terminals. Deze periode is niet ongebruikelijk vereiste tijd voor herstel van craniotomie.
Protocol
Representative Results
Discussion
In het huidige artikel presenteren we een protocol voor simultane twee-foton in vivo beeldvorming van de synaptische ingangen en postsynaptische targets in RSC door een craniale raam. De implantatieprocedure bestaan uit een aantal belangrijke stappen. Eerst wordt het dier verdoofd en diep in de stereotactische raamwerk aangebrachte vervolgens de schedel over RSC verdund met een boor langs de gemarkeerde cirkellijnen en de cirkelvormige bot wordt verwijderd. Nadat het bloeden is gestopt, wordt de rAAV2 / 1…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen graag M. Steczkowski bedanken voor stemopnames, M. Borczyk voor tekeningen, A. Trąbczyńska voor virus productie, M. Ziókowska voor genotypering en A. Mirgos voor hulp bij het filmen. KR erkent de vriendelijke gift van recombinant adeno-geassocieerd virus (rAAV) tot expressie mCherry fluorescerend eiwit onder de controle van CaMK promoter van K. Deisseroth. Dit project werd uitgevoerd bij de kernfaciliteiten van Laboratorium diermodellen en Laboratorium voor Tissue Structure and Function, Centrum voor Neurobiologie, Nencki Institute of Experimental Biology uitgevoerd, met het gebruik van de CEPT de infrastructuur door de Europese Unie wordt gefinancierd – het Europees Fonds voor Regionale ontwikkeling binnen het operationeel programma "innovatieve economie" voor de periode 2007-2013. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Science Centre: Sonata Bis 2012/05 / E / NZ4 / 02.996, Harmonia 2013/08 / M / NZ3 / 00.861, Symfonia 2013/08 / W / NZ24 / 00.691 tot KR en Sonata Bis 2014 / 14 / E / NZ4 / 00172 RC
Materials
| Drug | |||
| Isoflurane | Baxter | AErrane 8DG9623 | 5-2% pre-operative |
| Isoflurane | Baxter | AErrane 8DG9623 | 1.5-2% during surgery |
| Dexametasone | Scan Vet | Dexasone 2mg/ml | 0.2 mg/kg intramuscular |
| Baytril | Bayer | 2.50% | 5 mg/kg subcutaneously |
| Tolfedine | Vetoquinol | 4% | 4 mg/kg subcutaneously |
| Butomidor | Richter Pharma | 10 mg/ml | 2 mg/kg subcutaneously |
| Carprofen | KRKA-Polska | Rycarfa 50mg/ml | 10 mg/kg subcutaneously |
| Lidocaine | Jelfa | Lignocainum | topically |
| Lidocaine | Jelfa | 20 mg/g | topically |
| Surgery | |||
| Gelfoam | Ethicon | Spongostan dental; REF MS0005 | |
| Eye ointment | Dedra | Lubrithal | topically |
| CA glue | Pelikan Daniel | 20G Huste | |
| Dental acrylic | SpofaDental | Duracryl Plus | |
| Stereotaxic frame | Stoelting | 51500D | |
| Tool | |||
| Coverglass | Harvard Apparatus | HSE-64-0720 | 3 mm diameter |
| Dental drill | Sigmed | Keystone KVet | |
| Fixation bar | Custom made | N/A | M2 or M3 screw nuts could be used |
| Forceps | Renex | PN-7B-SA | |
| Micro scissors | Falcon | BM.183.180 | |
| Dissection microscope | KOZO | XTL6445T | |
| Imaging | |||
| Holder frame | Custom made | N/A | |
| Two-photon microscope | Zeiss | Upright Axio Examiner Z1 | Laser unit: Coherent Chameleon 690-1040nm with Optical Parametric Oscillator 1050-1300nm. Objectives: EC-PLAN-NEUFLUAR 10x/0.1 and LD Plan-APOCHROMAT 20x/1.0. Detection: Zeiss bandpass filters BP 500-550 (GFP) and BP 570-610 (mCherry) separated by beam splitter at 560nm and coupled to two GaAsP photodetectors. |
| Reagent | |||
| Virus | gift from K. Deisseroth | Recombinant adeno-associated virus (rAAV) expressing fluorescent protein mCherry under the control of CaMK promoter |
Referencias
- Grutzendler, J., Gan, W. B. Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain. NeuroRx. 3, 489-496 (2006).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
- Trachtenberg, J. T., et al. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420, 788-794 (2002).
- Holtmaat, A., et al. Imaging neocortical neurons through a chronic cranial window. Cold Spring Harb Protoc. 2012, 694-701 (2012).
- Chow, D. K., et al. Laminar and compartmental regulation of dendritic growth in mature cortex. Nat Neurosci. 12, 116-118 (2009).
- Czajkowski, R., et al. Encoding and storage of spatial information in the retrosplenial cortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 8661-8666 (2014).
- Czajkowski, R., et al. Superficially projecting principal neurons in layer V of medial entorhinal cortex in the rat receive excitatory retrosplenial input. J Neurosci. 33, 15779-15792 (2013).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Couey, J. J., et al. Recurrent inhibitory circuitry as a mechanism for grid formation. Nat Neurosci. 16, 318-324 (2013).
- Miyashita, T., Rockland, K. S. GABAergic projections from the hippocampus to the retrosplenial cortex in the rat. European Journal of Neuroscience. 26, 1193-1204 (2007).
