Die gleichzeitige Zwei-Photonen<em> In Vivo</em> Imaging der synaptischen Eingänge und Postsynaptische Targets in der Maus retrosplenialen Cortex
Summary
This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in mouse retrosplenial cortex using in vivo two photon microscopy in Thy1-GFP transgenic line. This approach is combined with injection of mCherry-expressing adeno-associated virus into dorsal hippocampus. These techniques allow long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.
Abstract
This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon microscopy in Thy1-GFP transgenic mouse line. This approach creates a possibility to investigate the correlation of behavioural manipulations with changes in neuronal morphology in vivo.
The cranial window implantation procedure was considered to be limited only to the easily accessible cortex regions such as the barrel field. Our approach allows visualization of neurons in the highly vascularized RSC. RSC is an important element of the brain circuit responsible for spatial memory, previously deemed to be problematic for in vivo two-photon imaging.
The cranial window implantation over the RSC is combined with an injection of mCherry-expressing recombinant adeno-associated virus (rAAVmCherry) into the dorsal hippocampus. The expressed mCherry spreads out to axonal projections from the hippocampus to RSC, enabling the visualization of changes in both presynaptic axonal boutons and postsynaptic dendritic spines in the cortex.
This technique allows long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.
Introduction
Zwei-Photonen-Mikroskopie revolutioniert die Beobachtung der Gehirnaktivität in lebenden und lebenden Tier. Seit seiner Einführung im Jahr 1990 es schnell Popularität gewonnen und ist nun als eines der interessantesten und innovative Ansätze zur Untersuchung zahlreicher Aspekte der Hirnaktivität in vivo 1,2 umgesetzt. Diese Anwendungen umfassen Blutströmungsmessungen, neuronale Aktivierung (beispielsweise unter Verwendung von Calciumfüllstandsanzeiger oder immediate early Gene expression) und die Morphologie von neuronalen Zellen. Eine zunehmende Anzahl von Laboratorien Zweiphotonen – Mikroskope, die Technik in der gesamten wissenschaftlichen Welt als neuer Standard für die Umsetzung in vivo Bildgebung des Gehirns.
Der Standardansatz beinhaltet die Implantation des Schädelfenster (ein rundes Loch in den Schädel mit einem Deckglas bedeckt) über den Lauf oder visuellen Kortex des Gehirns von Mäusen 3. Als nächstes wird in Abhängigkeit von der Versuchsprotokoll, das mouse durchläuft eine Reihe von Visualisierung und Verhaltenstrainingseinheiten, so dass die Veränderungen in der Hirnaktivität und die neuronale Morphologie über 4,5 Zeit zu überwachen. In beiden Fällen wirkt sich die Kraniotomie nur den Scheitelbein, ohne die Nähte kreuzen. Es wird weitgehend angenommen, dass der Hauptnachteil der Technik leicht zugänglich Cortex wie der Lauf oder Sehrinde seine begrenzte Anwendung. Implantieren des kranialen Fenster über anderen Regionen stellt eine Menge Schwierigkeiten, aufgrund einer übermäßigen Blutungen und / oder räumliche Hinderung.
In dieser Arbeit schlagen wir vor der Implantation des kranialen Fenster über dem retrosplenialen cortex (RSC) als weitere mögliche interessierende Region für die Zwei-Photonen – Mikroskopie in vivo 6. RSC ist ein wichtiges Element des Gehirns Schaltung verantwortlich für die räumliche Gedächtnisbildung. Anatomisch ist RSC ein Teil eines neuronalen Netzes verbindet cortical, hippocampalen und thalamischen Regionen 7. Es istin einer Reihe von Verhaltensweisen, wie räumliches Lernen und Extinktion sowie räumliche Navigation 6 stark beteiligt.
Um die morphologischen Veränderungen der Neuronen zu visualisieren verwenden wir eine transgene Mauslinie, die das grün fluoreszierende Protein (GFP) unter der THY1 Promotor. Bei diesen Mäusen GFP wird in etwa 10% der Neuronen im Gehirn ermöglicht eine klare Visualisierung der kortikalen Axonen und Dendriten mit Zwei-Photonen – Mikroskopie 8 ausgedrückt. Eine weitere Neuerung , die wir vorschlagen , ist die Injektion eines rekombinanten adeno-assoziierten Virus – Serotyp 2/1 (rAAV2 / 1) Codieren eines rot fluoreszierendes Protein (mCherry) unter einer neuron-spezifischen Promotor CaMKII 9 in die tieferen Strukturen des Gehirns RSC Projizieren wie dem Hippocampus. Die Expression von rAAV2 / 1 mCherry im Hippocampus von Thy1-GFP – Maus ermöglicht die gleichzeitige Darstellung von prä- und postsynaptischen Elemente der Hippocampo-cortical Synapsen 10. Die rAAV-gesteuerte Expression von mCherry erfordert zwei bis drei Wochen für das Protein ausreichendes Niveau in den axonalen Terminals zu erreichen. Diese Frist ist mit der üblichen Zeitaufwand für die Wiederherstellung von Craniotomie konsistent.
Protocol
Representative Results
Discussion
In der aktuellen Papier präsentieren wir ein Protokoll für die gleichzeitige Zwei-Photonen – de – vivo – Bildgebung der synaptischen Eingänge und postsynaptischen Ziele im RSC durch ein Schädel-Fenster. Das Implantationsverfahren bestehen aus mehreren Schlüsselschritte. Zunächst wird das Tier tief anästhesiert und in dem stereotaktischen Rahmen befestigt, dann wird der Schädel über RSC wird entlang der markierten Kreislinien mit einem Bohrer ausgedünnt und die kreisförmige Knochen entfernt w…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten M. Steczkowski für Sprachaufnahmen, M. Borczyk für Zeichnungen, A. Trąbczyńska für die Virusproduktion, M. Ziókowska für die Genotypisierung und A. Mirgos für die Unterstützung bei Dreharbeiten zu danken. KR erkennt die Art Geschenk des rekombinanten Adeno-assoziierten Virus (rAAV) fluoreszierendes Protein mCherry unter der Kontrolle von CaMK Promotor von K. Deisseroth Ausdruck zu bringen. dem Europäischen Regionalentwicklungsfonds innerhalb – Dieses Projekt wurde in den Kernanlagen des Labors für Tiermodelle und Labor für Tissue Struktur und Funktion, Zentrum für Neurobiologie, Nencki Institut für Experimentelle Biologie, mit dem Einsatz von CePT Infrastruktur von der Europäischen Union finanziert werden durchgeführt das operationelle Programm "Innovative Wirtschaft" für den Zeitraum 2007-2013. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse von der National Science Centre unterstützt: Sonata Bis 2012/05 / E / NZ4 / 02996, Harmonia 2013/08 / M / NZ3 / 00861, Symfonia 2013/08 / W / NZ24 / 00691 zu KR und Sonata Bis 2014 / 14 / E / NZ4 / 00172 bis RC
Materials
| Drug | |||
| Isoflurane | Baxter | AErrane 8DG9623 | 5-2% pre-operative |
| Isoflurane | Baxter | AErrane 8DG9623 | 1.5-2% during surgery |
| Dexametasone | Scan Vet | Dexasone 2mg/ml | 0.2 mg/kg intramuscular |
| Baytril | Bayer | 2.50% | 5 mg/kg subcutaneously |
| Tolfedine | Vetoquinol | 4% | 4 mg/kg subcutaneously |
| Butomidor | Richter Pharma | 10 mg/ml | 2 mg/kg subcutaneously |
| Carprofen | KRKA-Polska | Rycarfa 50mg/ml | 10 mg/kg subcutaneously |
| Lidocaine | Jelfa | Lignocainum | topically |
| Lidocaine | Jelfa | 20 mg/g | topically |
| Surgery | |||
| Gelfoam | Ethicon | Spongostan dental; REF MS0005 | |
| Eye ointment | Dedra | Lubrithal | topically |
| CA glue | Pelikan Daniel | 20G Huste | |
| Dental acrylic | SpofaDental | Duracryl Plus | |
| Stereotaxic frame | Stoelting | 51500D | |
| Tool | |||
| Coverglass | Harvard Apparatus | HSE-64-0720 | 3 mm diameter |
| Dental drill | Sigmed | Keystone KVet | |
| Fixation bar | Custom made | N/A | M2 or M3 screw nuts could be used |
| Forceps | Renex | PN-7B-SA | |
| Micro scissors | Falcon | BM.183.180 | |
| Dissection microscope | KOZO | XTL6445T | |
| Imaging | |||
| Holder frame | Custom made | N/A | |
| Two-photon microscope | Zeiss | Upright Axio Examiner Z1 | Laser unit: Coherent Chameleon 690-1040nm with Optical Parametric Oscillator 1050-1300nm. Objectives: EC-PLAN-NEUFLUAR 10x/0.1 and LD Plan-APOCHROMAT 20x/1.0. Detection: Zeiss bandpass filters BP 500-550 (GFP) and BP 570-610 (mCherry) separated by beam splitter at 560nm and coupled to two GaAsP photodetectors. |
| Reagent | |||
| Virus | gift from K. Deisseroth | Recombinant adeno-associated virus (rAAV) expressing fluorescent protein mCherry under the control of CaMK promoter |
Referencias
- Grutzendler, J., Gan, W. B. Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain. NeuroRx. 3, 489-496 (2006).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
- Trachtenberg, J. T., et al. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420, 788-794 (2002).
- Holtmaat, A., et al. Imaging neocortical neurons through a chronic cranial window. Cold Spring Harb Protoc. 2012, 694-701 (2012).
- Chow, D. K., et al. Laminar and compartmental regulation of dendritic growth in mature cortex. Nat Neurosci. 12, 116-118 (2009).
- Czajkowski, R., et al. Encoding and storage of spatial information in the retrosplenial cortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 8661-8666 (2014).
- Czajkowski, R., et al. Superficially projecting principal neurons in layer V of medial entorhinal cortex in the rat receive excitatory retrosplenial input. J Neurosci. 33, 15779-15792 (2013).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Couey, J. J., et al. Recurrent inhibitory circuitry as a mechanism for grid formation. Nat Neurosci. 16, 318-324 (2013).
- Miyashita, T., Rockland, K. S. GABAergic projections from the hippocampus to the retrosplenial cortex in the rat. European Journal of Neuroscience. 26, 1193-1204 (2007).
