동시에 두 광자<em> 생체</em> 마우스 Retrosplenial 코어 텍스에서 시냅틱 입력의 이미징 및 시냅스 대상
Summary
This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in mouse retrosplenial cortex using in vivo two photon microscopy in Thy1-GFP transgenic line. This approach is combined with injection of mCherry-expressing adeno-associated virus into dorsal hippocampus. These techniques allow long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.
Abstract
This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon microscopy in Thy1-GFP transgenic mouse line. This approach creates a possibility to investigate the correlation of behavioural manipulations with changes in neuronal morphology in vivo.
The cranial window implantation procedure was considered to be limited only to the easily accessible cortex regions such as the barrel field. Our approach allows visualization of neurons in the highly vascularized RSC. RSC is an important element of the brain circuit responsible for spatial memory, previously deemed to be problematic for in vivo two-photon imaging.
The cranial window implantation over the RSC is combined with an injection of mCherry-expressing recombinant adeno-associated virus (rAAVmCherry) into the dorsal hippocampus. The expressed mCherry spreads out to axonal projections from the hippocampus to RSC, enabling the visualization of changes in both presynaptic axonal boutons and postsynaptic dendritic spines in the cortex.
This technique allows long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.
Introduction
이광자 현미경 살고 동물 행동에서 뇌 활동의 관찰 혁명. 1990 년 출시 이후 빠르게 인기를 얻고 지금은 생체 내 1,2에서 뇌 활동의 다양한 측면의 검토를 향해 가장 흥미롭고 혁신적인 접근 방법의 하나로서 구현된다. 이러한 애플리케이션 및 신경 세포의 형태 (칼슘 수준 지표 또는 즉각적인 초기 유전자의 발현을 사용하여, 예), 혈류 측정, 신경 활성을 포함한다. 실험실의 증가는 생체 뇌 영상을위한 새로운 표준으로 과학 세계 기술을 구현, 두 광자 현미경을 사용합니다.
표준 접근법은 뇌 창 주입 배럴 또는 마우스 뇌의 시각 피질 3 이상 (커버 유리 피복 두개의 원형 구멍)를 포함한다. 다음으로, 실험 프로토콜에 따라 각서SE 시간 걸쳐 4,5- 뇌 신경 활성 및 형태의 변화를 모니터링 할 수 있도록 시각화 행동 훈련 일련 겪는다. 두 경우 모두 개두술은 봉합을 횡단하지 않고 정수리 뼈에 영향을 미친다. 주로 기술의 주요 단점은 배럴 또는 시각 피질로 쉽게 접근 대뇌 피질에 제한된 응용 프로그램입니다 것으로 생각된다. 다른 지역에 걸쳐 두개골 창 주입으로 인해 과도한 출혈 및 / 또는 공간 방해로 어려움을 많이 포즈.
본 논문에서는 생체 현미경 (6)의 두 광자에 대한 관심의 또 다른 가능한 영역과 retrosplenial 피질 (RSC) 위의 두개골 윈도우의 주입을 제안한다. RSC는 공간 기억 형성을 담당 뇌 회로의 중요한 소자이다. 해부학, RSC는 대뇌 피질, 해마, 시상 영역 (7)를 연결하는 신경 네트워크의 일부입니다. 그것은이다주로 이러한 공간 학습 및 소등과 탐색 공간 (6)과 같은 행동의 범위에 포함했다.
신경 세포의 형태 학적 변화를 시각화하기 위해 우리는 thy1 발기인에서 녹색 형광 단백질 (GFP)를 발현하는 형질 전환 마우스 라인을 사용합니다. 이러한 쥐, GFP는 이광자 현미경 8을 사용 피질 축삭 돌기 명확한 시각화를 허용 뇌 신경 세포의 약 10 %에서 발현된다. 우리가 제안하는 또 다른 혁신은 RSC로 돌출 된 뇌의 깊은 구조로 신경 세포 특이 camkii 프로모터 (9)에서 적색 형광 단백질 (mCherry)를 코딩하는 재조합 아데노 관련 바이러스 혈청 형 2/1 (/ 1 rAAV2)의 주입입니다 해마 등. Thy1-GFP 마우스의 해마에서 rAAV2 / 1 mCherry의 발현은 hippocampo-cortica의 사전 및 시냅스 요소를 동시에 시각화 할 수 있습니다난 10 시냅스. 단백질이 축삭 터미널에 충분한 수준에 도달 할 mCherry의 rAAV 중심의 표현은 2~3주이 필요합니다. 이 기간은 개두술 회복에 필요한 통상의 시간과 일치한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
현재 논문에서 우리는 두개골 창을 통해 RSC에서 시냅스 입력과 시냅스 대상의 생체 내 이미징에서 동시에 두 광자를위한 프로토콜을 제시한다. 주입 절차는 몇 가지 주요 단계로 구성되어 있습니다. 첫째, 동물 깊이 마취 및 정위 프레임에 고정되어, 다음 RSC를 통해 두개골이 표시된 원형 라인을 따라 드릴 원형 뼈를 제거하여 얇게된다. 출혈이 중지되면 rAAV2 / 1 mCherry는 해마에 주?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 촬영에 도움을 음성 녹음, 그림에 대한 M. Borczyk, 바이러스 생산을위한 A. Trąbczyńska, 유전자형에 대한 M. Ziókowska 및 A. Mirgos에 대한 M. Steczkowski에게 감사의 말씀을 전합니다. KR은 K. Deisseroth에서 CaMK 프로모터의 제어하에 형광 단백질 mCherry을 표현하는 재조합 아데노 관련 바이러스 (rAAV)의 종류 선물을 인정합니다. 이 프로젝트는 유럽 연합 (EU)에 의해 재정 CEPT 인프라를 사용하여, 조직의 구조와 기능, 신경 생물학, 실험 생물학의 Nencki 연구소의 센터의 동물 모델 및 연구소의 실험실의 핵심 시설에서 수행 한 – 유럽 지역 개발 기금 내를 2,007에서 2,013 사이의 운영 프로그램 "혁신 경제". 이 작품은 국립 과학 센터에서 보조금에 의해 지원되었다 : 소나타 비스 2012 / 05 / E / NZ4 / 02996, 하모니아 2013 / 08 / M / NZ3 / 00861, Symfonia 2013 / 08 / W / KR과 소나타 비스 2014 NZ24 / 00691 / 14 / E / NZ4 / 00172 RC에
Materials
| Drug | |||
| Isoflurane | Baxter | AErrane 8DG9623 | 5-2% pre-operative |
| Isoflurane | Baxter | AErrane 8DG9623 | 1.5-2% during surgery |
| Dexametasone | Scan Vet | Dexasone 2mg/ml | 0.2 mg/kg intramuscular |
| Baytril | Bayer | 2.50% | 5 mg/kg subcutaneously |
| Tolfedine | Vetoquinol | 4% | 4 mg/kg subcutaneously |
| Butomidor | Richter Pharma | 10 mg/ml | 2 mg/kg subcutaneously |
| Carprofen | KRKA-Polska | Rycarfa 50mg/ml | 10 mg/kg subcutaneously |
| Lidocaine | Jelfa | Lignocainum | topically |
| Lidocaine | Jelfa | 20 mg/g | topically |
| Surgery | |||
| Gelfoam | Ethicon | Spongostan dental; REF MS0005 | |
| Eye ointment | Dedra | Lubrithal | topically |
| CA glue | Pelikan Daniel | 20G Huste | |
| Dental acrylic | SpofaDental | Duracryl Plus | |
| Stereotaxic frame | Stoelting | 51500D | |
| Tool | |||
| Coverglass | Harvard Apparatus | HSE-64-0720 | 3 mm diameter |
| Dental drill | Sigmed | Keystone KVet | |
| Fixation bar | Custom made | N/A | M2 or M3 screw nuts could be used |
| Forceps | Renex | PN-7B-SA | |
| Micro scissors | Falcon | BM.183.180 | |
| Dissection microscope | KOZO | XTL6445T | |
| Imaging | |||
| Holder frame | Custom made | N/A | |
| Two-photon microscope | Zeiss | Upright Axio Examiner Z1 | Laser unit: Coherent Chameleon 690-1040nm with Optical Parametric Oscillator 1050-1300nm. Objectives: EC-PLAN-NEUFLUAR 10x/0.1 and LD Plan-APOCHROMAT 20x/1.0. Detection: Zeiss bandpass filters BP 500-550 (GFP) and BP 570-610 (mCherry) separated by beam splitter at 560nm and coupled to two GaAsP photodetectors. |
| Reagent | |||
| Virus | gift from K. Deisseroth | Recombinant adeno-associated virus (rAAV) expressing fluorescent protein mCherry under the control of CaMK promoter |
Referencias
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