Imaging subcellulära strukturer i vardagsZebraFish Embryo

In vivo imaging ger direkt visualisering av cellulära beteenden på det mest fysiologiskt sammanhang. Öppenheten i zebrafisk embryon, deras snabba och extern utveckling och ett rikt utbud av genetiska verktyg som tillåter fluorescensmärkning har alla bidragit till den ökande användningen av in vivo mikroskopi för att belysa dynamiken i viktiga utvecklings händelser. Imaging studier av nervsystemets utveckling i zebrafisk har exempelvis kraftigt utökat vår kunskap om beteendet hos neurala stamceller och öde deras avkomma inklusive deras efterföljande migration, differentiering och krets integration ^1-8.

Scenen är nu inställd på att undersöka subcellulära dynamik som ligger bakom dessa cellulära beteenden. Faktum är zebrafisk redan utnyttjas som verktyg för in vivo cellbiologi. Det är nu möjligt att visualisera mitokondrier ^9-11, centrosom ^2,8,12-14, Golgi ¹⁵, Mikrotubuli ⁴ och aktin ¹⁶ cytoskelettet, endosomer ¹⁷ och komponenterna i det apikala membranet komplexa ^1,18, bland andra subcellulära strukturer i zebrafisk embryon in vivo. Hittills har mycket av vad som är känt om funktionen av dessa organeller kommer från att studera deras beteende i odlade celler. In vitro-studier har gett medan enorm inblick i cellbiologi, gör celler i odling är helt representativ för komplicerade situationen in vivo och därför inte nödvändigtvis återspeglar den funktion och dynamik subcellulära organeller in vivo. Zebrafisk embryon har en livskraftig in vivo alternativ till undersöker subcellulära dynamik.

Som ryggradsdjur, zebrafisk har många organsystem (t.ex. neurala näthinnan) som är homologa med de som återfinns i däggdjursarter. Dessutom är zebrafisk embryon alltmer för att modellera mänskliga sjukdomar ^19,20 </supp>, inklusive de som rör centrosomal funktion (t.ex. mikrocefali ²¹ och Lebers kongenitala amauros ²²⁾ och mitokondriefunktion (t.ex. Parkinsons sjukdom ^23, tauopatier ^10,24 och Barth syndrom ^25). In vivo imaging på cellulär och subcellulär nivå i dessa fall kommer att möjliggöra en bättre förståelse av cellbiologi bakom dessa patologiska tillstånd.

Det övergripande målet för de metoder som beskrivs här är att ge en heltäckande guide för att undersöka organeller och andra subcellulära strukturer i zebrafisk embryon genom att använda in vivo ljusmikroskop. Hela arbetsflödet involverade i att visualisera och spåra subcellulära strukturer in vivo beskrivs – från genetiska märkningsmetoder, för att generera transient uttrycka och stabil transgen fisk, och slutligen till avbildning med brett fält och konfokalmikroskopi. Även om var och en av dessa procedures används av många zebrafisk laboratorier är protokollen optimerade och strömlinjeformad för att undersöka dynamiken i subcellulära strukturer. Två särskilda aspekter av det arbete som beskrivs här garanterar nämna: För det första, användningen av Gal4-UAS expressionssystem i flera konfigurationer för genetiskt etikettorgan i specifika celltyper. För det andra, en direkt jämförelse av brett fält och konfokalmikroskopi till bild subcellulära strukturer in vivo.

Nuvarande strategier för att genetiskt etikettorganeller och andra subcellulära strukturer i zebrafisk antingen utnyttja utjämnade mRNA ^1,4,8 eller DNA-baserade konstruktioner där promotorelement direkt driva uttryck av fusionsproteiner ^9,14,15. In vitro transkriberade utjämnade RNA resulterar i snabb och bred uttryck, som inte är vävnadsspecifik dock. Dessutom, uttrycksnivåer minska med tiden som det utjämnade RNA späds eller försämras. Således användningen av RNA baseradkonstruktioner att undersöka organell dynamiken i ett senare skede i utvecklingen är begränsad (vanligtvis upp till tre dagar efter befruktningen).

Dessa begränsningar kan övervinnas genom användning av DNA-konstruktioner, där rumsliga och tidsmässiga kontroll av uttryckning bestäms av specifika promotorelement. När DNA-baserade konstruktioner används i samband med de Gal4-UAS systemet betydande förbättringar av transgena expressionsnivåer iakttas ^26,27. I detta tvåparts expressionssystem, cell typspecifika promotorelement driva expressionen av en transkriptionell aktivator Gal4, medan reportergener klonas nedströms om Gal4-bindande uppströmsaktiverande sekvensen (UAS). Genom att kombinera UAS reportrar med lämpliga Gal4 förare, kan uttryck begränsas till specifika celltyper, kringgår behovet att klona reportergener bakom olika promotorer varje gång ett specifikt uttryck mönster önskas. Vidare kan uttrycket av multipla UAS reportergener varadriven av en enda Gal4 aktivator. Gal4-UAS systemet ger således en mångsidig och flexibel genetiska tillvägagångssätt för subcellulär märkning.

Brett fält och konfokala mikroskop är arbetshästar i de flesta laboratorier. Wide-fält system använder typiskt en båglampa som ljuskälla och detektera det emitterade ljuset med en känslig kamera som är placerad vid änden av ljusvägen. Denna avbildning modalitet vanligtvis begränsad till tunna prover utanför fokus ljus döljer fokus information tjockare prover. Konfokala mikroskop skiljer sig från brett fält system genom att de är byggda för att gynna signaler som kommer från fokalplanet över dem som har sitt ursprung ur fokus (dvs "optisk sektionering") ^28. För att uppnå optisk sektione ett nålhål placeras i banan emission i ett konjugat läge till punkten ljuskälla. Lasrar används som ljuskällor och signaler detekteras med fotomultiplikatorrör (PMT). Praktiskt, en lasertrålen dras över provet punkt-för-punkt och fluorescensemissionen vid varje fläck (pixel) detekteras av PMT.

Här har vi bild precis samma subcellulära strukturer i levande zebrafisk embryon med både brett fält och konfokalmikroskopi för att ge en direkt jämförelse mellan de båda mikroskopi formerna. Den underliggande syfte att ge sådana jämförelser är att erbjuda riktlinjer för att välja den mest lämpliga mikroskopi teknik för den specifika frågan till hands.

Med hjälp av metoder som beskrivs här visar vi Gal4-UAS baserad genetisk märkning av mitokondrier och centrosom. Dessa organeller är avbildade i olika celltyper i nervsystemet och i muskelcellerna med användning av brett fält och konfokalmikroskopi för att demonstrera lämpligheten hos varje avbildningsmodalitet. De metoder som beskrivs här kan lätt anpassas för att undersöka andra organeller och subcellulära strukturer i levande zebrafisk embryo.