Análisis del filtro de aire en la muestra de endotoxinas y contenido de ADN
Summary
Two complementary analyses of atmospheric biological particles from air sampled filters are described herein: the extraction and detection of endotoxin, and of DNA.
Abstract
la investigación de aerosol al aire libre comúnmente utiliza partículas muestreada en los filtros. Este procedimiento permite diversas caracterizaciones de las partículas recogidas que se realizan en paralelo. El propósito del método presentado aquí es obtener un análisis muy preciso y fiable del contenido de endotoxina y ADN de bio-aerosoles extraídos de filtros. La extracción de las moléculas de alto peso molecular orgánicos, tales como lipopolisacáridos, de los filtros de la muestra implica agitando la muestra en un medio a base de agua libre de pirógenos. El posterior análisis se basa en una reacción enzimática que puede detectarse utilizando una medición turbidimétrico. Como resultado de la alto contenido orgánico en los filtros en la muestra, la extracción de ADN de las muestras se realiza usando un kit de extracción de ADN comercial que fue diseñado originalmente para suelos y modificado para mejorar el rendimiento de ADN. La detección y cuantificación de especies microbianas específicas utilizando Reacti cadena de la polimerasa cuantitativaen el análisis (q-PCR) se describen y se comparan con otros métodos disponibles.
Introduction
El muestreo del aire en los filtros es una herramienta básica en la investigación de los aerosoles atmosféricos. 1 Los filtros de la muestra son el punto de partida para diversos productos químicos, físicos y caracterizaciones biológicas de las partículas ambientales recogidos. 2-11 La ventaja de este enfoque es que varios análisis pueden ser realizado fuera de línea en la misma muestra. La compilación de los datos de todos los diferentes análisis permite al investigador para obtener una buena comprensión de las características de las partículas y las ayudas recogidas en la resolución de cuestiones complejas en las ciencias de la atmósfera 12,13. Por ejemplo, los acondicionadores de muestras marinas y continentales tomadas durante el mismo período puede compararse con respecto a la toxicidad de las partículas en la muestra y la composición biológica. 14 para este estudio, los lipopolisacáridos (LPS), componentes de paredes celulares bacterianas gram-negativas, también conocidos como endotoxinas, se extrajeron de los filtros en la muestra en tierra y en un sitio en el interior, y se evaluaron utilizando elamebocitos de Limulus lisado (LAL). En paralelo, una evaluación genómica del contenido bacteriano (total de bacterias, gram negativo, y cianobacterias) se realizó en la misma muestra usando la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (Q-PCR). La prueba de LAL se basa en mediciones de turbidez formados después de la adición de un extracto acuoso de amebocitos del cangrejo de herradura, Limulus polyphemus, a una solución acuosa que contiene las endotoxinas. Cuanto mayor sea la concentración de endotoxina en la muestra, la turbidez más rápido se desarrolla. 15 El análisis q-PCR se basa en una señal de fluorescencia emitida como un fragmento de ADN específico se amplifica. 16 Por la monitorización en tiempo real de la señal durante la fase exponencial de la PCR reacción y de calibración con una curva estándar, la cantidad inicial de ADN se pueden cuantificar. La combinación de estos dos análisis junto con otros, como se detalla en otro lugar, 14 puede proporcionar una buena estimación de los niveles de endotoxina y de lacantidad de las bacterias de origen en las muestras.
El propósito del método presentado aquí es obtener un análisis muy preciso y fiable del contenido de endotoxina y ADN de bio-aerosoles extraídos de filtros. Si bien los métodos de muestreo de las características físicas y químicas inorgánicas de aerosoles son bien conocidos y, más recientemente, se han desarrollado métodos para investigar su componente de materia orgánica, 17 no ha sido escasa la investigación sobre el componente biológico de aerosoles. 18 La razón de la corriente método consiste en llenar este vacío mediante la presentación en detalle un método robusto para la extracción, el análisis y la identificación de la fracción biológica de los aerosoles en el aire. 14
Se espera que el método detallado aquí para encontrar amplio uso en proyectos de investigación en aerosol interiores y exteriores biológicos que implican análisis de filtro. 20-24
Protocol
Representative Results
Discussion
Este trabajo describe los métodos de extracción y detección para cuantificar tanto las endotoxinas y ADN presente en las muestras recogidas en los filtros de aerosol. Los métodos requieren rutinas precisos y se pueden realizar fácilmente, siempre que el experimentador se adhiere a algunos puntos esenciales e importantes discutidos aquí.
Para la etapa de detección de endotoxinas, tenga en cuenta que la solución de lisado es bastante viscoso y tiende a producir burbujas en la pipeta. E…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Dr. Yoav Barak from the Chemistry Faculty, Weizmann Institute, for support and advice. This study was supported by the Israel Science Foundation (grant # 913/12), and by the Minerva Foundation with funding from the Federal German Ministry for Education and Research.
Materials
| Filter sampling | |||
| HiVol 3000 – High Air Volume Sampler | Ecotech | ||
| Quartz Microfiber Filters | Whatman | 1851-865 | 203mm X 254mm |
| ELF – Laboratory Chamber Furnaces | Carbolite | ELF 11series | |
| Aluminum foil | Opal | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Endotoxin | |||
| Ethanol | Sigma Aldrich | 16368 | Laboratory Reagent, 96% |
| Airstream Class II Biological Safety Cabinet AC-4E1 | ESCO | 10011712 | |
| Pyrotell -T | Associates of Cape Cod, Inc. | T0051 | |
| Control Standard Endotoxin | Associates of Cape Cod, Inc. | E0005-1 | Escherichia coli O113:H10, 0.5 µg/vial 1 Pack |
| LAL Reagent Water | Associates of Cape Cod, Inc. | W0051 | |
| 10 mL sterile syringe with Luer-Lok Tip | Becton-Dickinson & Co. | 309605 | |
| BD Precisionglide syringe needle | Becton-Dickinson & Co. | 305129 | Sterile |
| Parafilm-M sealing tape | Parafilm | P7543 | Sigma catalog number |
| Microtubes | Axigen | MCT-200-C | 2ml, pyrogen free |
| 1.12 cm diameter Cork Borer | Boekel Scientific | 1601 BD Series – Steel | Part of a cork borer set containing borers with various diameters. |
| 50 mm Petri Dish | Miniplast Ein-Shemer | 72050-01 | Aseptic |
| Vortex Genie 2 | Scientific Industries, inc. | SI-0297 | |
| Microcentrifuge 5415 D | Eppendorf | 22621408 | |
| TC MicroWell 96 F SI w/lid | Nunc | 167008 | Flat bottom wells (with lid (individually wrapped)), sterile, pyrogen free |
| Synergy HT Multi-Detection Microplate Reader | Biotek | 7091000 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNA | |||
| DNA away | Sigma Aldrich | 7010 | |
| Standard DNA of the microbial species of interest | ATCC or other culture collection | Either the appropriate microbial strain for DNA extraction or the extracted DNA | |
| Neubauer-improved | Marienfeld | 640030 | hemocytometer |
| TE buffer, Low EDTA | Life Technologies | 12090-015 | 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) 0.1 mM EDTA |
| Nuclease-free PCR-grade water | Sigma Aldrich | 3315959001 | |
| PCR primers | Sigma Aldrich | Targets the microbial species of interest | |
| Dual-Labeled Probes | Sigma Aldrich | Targets the microbial species of interest | |
| Screw cap tubes | Axigen | ST-200-SS | 2 mL |
| PowerSoil DNA extraction kit | Mo Bio Laboratories | 12888-100 | |
| Glass beads, acid-washed 425-600 Microns | Sigma Aldrich | G8772-100G | |
| Glass beads, acid-washed <106 microns | Sigma Aldrich | G4649-100G | |
| PowerSoil Solution C1 | Mo Bio Laboratories | 12888-100-1 | Cell lysis buffer , Power soil Kit |
| Magic Touch ice bucket | Bel-Art | 18848-4001 | |
| Mini-Beadbeater-16 | BioSpec | 607EUR | |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4376600 | |
| Fast SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | 4385612 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystems | 4370048 | |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode, 0.1 mL | Applied Biosystems | 4346906 | |
| MicroAmp Splash-Free 96-Well Base | Applied Biosystems | 4312063 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems | 4311971 | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 5811 000.010 | Rotor A-4-62 with MTP buckets |
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