독소와 DNA 내용에 대한 공기 샘플링 필터 분석
Summary
Two complementary analyses of atmospheric biological particles from air sampled filters are described herein: the extraction and detection of endotoxin, and of DNA.
Abstract
야외 에어로졸 연구는 일반적으로 필터에 샘플링 된 입자상 물질을 사용합니다. 이 절차는 수집 된 입자의 다양한 특성 분석이 병렬로 수행 될 수있다. 여기에 제시된 방법의 목적은 필터로부터 추출한 생체 에어로졸 독소 및 DNA 콘텐츠 매우 정확하고 신뢰성있는 분석을 얻을 수있다. 샘플링 필터와 리포 폴리 사카 라이드와 같은 고 분자량의 유기 분자의 추출은 발열원이없는 수성 매질에서 샘플을 진동하는 것을 포함한다. 후속 분석을 혼탁도 측정을 이용하여 검출 할 수 효소 반응에 기초한다. 샘플링 필터에 대한 높은 유기 함량의 결과로서, 샘플의 DNA의 추출은 원래의 토양에 대한 설계 DNA 수율을 개선하기 위해 수정 된 상업적인 DNA 추출 키트를 사용하여 수행된다. 검출 및 정량 중합 효소 연쇄를 Reacti를 이용하여 특정 종의 미생물 정량(Q-PCR) 분석 기술 및 사용 가능한 다른 방법과 비교된다.
Introduction
필터에 공기 샘플링 대기 에어로졸 연구에서 기본적인 도구이다. 한 샘플링 필터는 다양한 화학적, 물리적, 및 수집 된 주변 입자의 생물학적 특성화를위한 시작점이다. 2-11이 방법의 장점은 여러 가지 분석 될 수 있다는 동일한 샘플에 오프라인으로 수행. 연구원을 모든 다른 분석에서 데이터를 가능하게 컴파일하면 대기 과학 분야의 복잡한 문제 해결에 수집 된 입자와 보조기구의 특성을 잘 이해를 얻을. 12, 13 예를 들어, 해양 및 내륙 공기 샘플은 같은 기간 동안 촬영 기간이 연구 샘플링 입자 독성 생물 조성물. (14)에 대해 비교 될 수 있으며, 리포 폴리 사카 라이드 (LPS), 또한 내 독소라고도 그람 음성 박테리아 세포 벽의 성분은 육상과 샘플링 필터로부터 추출 된 내륙 사이트 및 사용하여 평가 하였다물러 amebocyte 용 해물 (LAL) 테스트. 병행하여, 박테리아 게놈 콘텐츠 평가 (총 세균, 그램 네거티브 및 시아 노 박테리아) 정량 중합 효소 연쇄 반응 (Q-PCR)을 사용하여 동일한 샘플상에서 수행 하였다. LAL 시험 독소를 함유하는 수용액에, 참게, 물러의 polyphemus에서 amebocytes의 수성 추출물을 첨가 한 다음에 형성 탁도 측정에 기초한다. 샘플에서 높은 내 독소 농도는 빠른 탁도 발생한다. 15 Q-PCR 분석은 특정한 DNA 단편을 증폭으로 방출 형광 신호에 기초한다. (16) 신호의 실시간 모니터링함으로써 PCR의 지수 단계 표준 곡선과의 반응 및 교정은 초기 DNA 량을 정량 할 수있다. 이 두 가지의 조합은 다른 설명 된대로, 14 및 독소의 레벨의 양호한 추정을 제공 할 수있는 다른 사람들과 함께 분석샘플 소스 박테리아의 양.
여기에 제시된 방법의 목적은 필터로부터 추출한 생체 에어로졸 독소 및 DNA 콘텐츠 매우 정확하고 신뢰성있는 분석을 얻을 수있다. 에어로졸의 물리적 및 무기 화학 특성을 샘플링하는 방법은,보다 최근에 방법이 그 유기물 성분을 조사하기 위해 개발 된 공지되어 있지만,도 17은 에어로졸의 생물학적 성분에 부족한 연구되고있다. (18)는 현재의 근거 방법은 구체적으로, 추출 분석 및 공기 에어로졸 생물학적 부분을 식별하기위한 강력한 방법을 제공함으로써이 갭을 해결하는 것이다. (14)
여기에 설명 된 방법은 필터의 분석을 포함하는 생물학적 실내 및 실외 에어로졸 연구 프로젝트에 대폭적인 사용을 찾을 것으로 예상된다. 20-24
Protocol
참고 : 모든 재료와이 프로토콜에 사용되는 악기의 자세한 목록은 자료 섹션에 표시됩니다. 필터 1. 에어 샘플링 필터의 제조 높은 볼륨 샘플링의 경우, 20.3 X 25.4 cm (2) 필터를 사용합니다. 가장 연구 요구에 적합한 필터의 특정 유형뿐만 아니라, 필터 컷오프 크기가 적용되는 경우를 선택한다. (1) 여기서 사용 석영 마이크로 필터. 유기 ?…
Representative Results
그것은 "오프라인"샘플링 필터를 분석을 사용하여 대기 에어로졸을 학습하는 것이 일반적이다 (도 2 참조). (32) 화학 샘플링없이 유기 (예 : 단백질, 탄화수소 분자 당) 및 무기 (예를 들어 금속 염)을 포함하는 콘텐츠 분석 . 생물학적 분석 가능한 비 생존 미생물 함량 DNA 방법 또는 현미경을 사용하여 종 식별뿐만 아니라 기반 DNA 정…
Discussion
이 작품은 필터에 수집 된 에어로졸 샘플에서 독소와 DNA의 존재를 모두 정량 추출 및 검출 방법을 설명합니다. 정확한 방법은 루틴을 필요로 한 실험자 여기서 설명한 몇몇 필수적인 중요한 점 접착 쉽게 수행 될 수있다.
독소 검출 단계, 파쇄 용액은 매우 점성과 피펫에 버블을 생성하는 경향이 있습니다. 너를 거품 제거하기 곤란하며, 이들은 마이크로 플레이트 리더 값의 ?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Dr. Yoav Barak from the Chemistry Faculty, Weizmann Institute, for support and advice. This study was supported by the Israel Science Foundation (grant # 913/12), and by the Minerva Foundation with funding from the Federal German Ministry for Education and Research.
Materials
| Filter sampling | |||
| HiVol 3000 – High Air Volume Sampler | Ecotech | ||
| Quartz Microfiber Filters | Whatman | 1851-865 | 203mm X 254mm |
| ELF – Laboratory Chamber Furnaces | Carbolite | ELF 11series | |
| Aluminum foil | Opal | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Endotoxin | |||
| Ethanol | Sigma Aldrich | 16368 | Laboratory Reagent, 96% |
| Airstream Class II Biological Safety Cabinet AC-4E1 | ESCO | 10011712 | |
| Pyrotell -T | Associates of Cape Cod, Inc. | T0051 | |
| Control Standard Endotoxin | Associates of Cape Cod, Inc. | E0005-1 | Escherichia coli O113:H10, 0.5 µg/vial 1 Pack |
| LAL Reagent Water | Associates of Cape Cod, Inc. | W0051 | |
| 10 mL sterile syringe with Luer-Lok Tip | Becton-Dickinson & Co. | 309605 | |
| BD Precisionglide syringe needle | Becton-Dickinson & Co. | 305129 | Sterile |
| Parafilm-M sealing tape | Parafilm | P7543 | Sigma catalog number |
| Microtubes | Axigen | MCT-200-C | 2ml, pyrogen free |
| 1.12 cm diameter Cork Borer | Boekel Scientific | 1601 BD Series – Steel | Part of a cork borer set containing borers with various diameters. |
| 50 mm Petri Dish | Miniplast Ein-Shemer | 72050-01 | Aseptic |
| Vortex Genie 2 | Scientific Industries, inc. | SI-0297 | |
| Microcentrifuge 5415 D | Eppendorf | 22621408 | |
| TC MicroWell 96 F SI w/lid | Nunc | 167008 | Flat bottom wells (with lid (individually wrapped)), sterile, pyrogen free |
| Synergy HT Multi-Detection Microplate Reader | Biotek | 7091000 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNA | |||
| DNA away | Sigma Aldrich | 7010 | |
| Standard DNA of the microbial species of interest | ATCC or other culture collection | Either the appropriate microbial strain for DNA extraction or the extracted DNA | |
| Neubauer-improved | Marienfeld | 640030 | hemocytometer |
| TE buffer, Low EDTA | Life Technologies | 12090-015 | 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) 0.1 mM EDTA |
| Nuclease-free PCR-grade water | Sigma Aldrich | 3315959001 | |
| PCR primers | Sigma Aldrich | Targets the microbial species of interest | |
| Dual-Labeled Probes | Sigma Aldrich | Targets the microbial species of interest | |
| Screw cap tubes | Axigen | ST-200-SS | 2 mL |
| PowerSoil DNA extraction kit | Mo Bio Laboratories | 12888-100 | |
| Glass beads, acid-washed 425-600 Microns | Sigma Aldrich | G8772-100G | |
| Glass beads, acid-washed <106 microns | Sigma Aldrich | G4649-100G | |
| PowerSoil Solution C1 | Mo Bio Laboratories | 12888-100-1 | Cell lysis buffer , Power soil Kit |
| Magic Touch ice bucket | Bel-Art | 18848-4001 | |
| Mini-Beadbeater-16 | BioSpec | 607EUR | |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4376600 | |
| Fast SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | 4385612 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystems | 4370048 | |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode, 0.1 mL | Applied Biosystems | 4346906 | |
| MicroAmp Splash-Free 96-Well Base | Applied Biosystems | 4312063 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems | 4311971 | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 5811 000.010 | Rotor A-4-62 with MTP buckets |
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Citar este artículo
Lang-Yona, N., Mazar, Y., Pardo, M., Rudich, Y. Air-sampled Filter Analysis for Endotoxins and DNA Content. J. Vis. Exp. (109), e53444, doi:10.3791/53444 (2016).