Un modello cellule endoteliali Planar for Imaging immunologiche Synapse Dynamics

Linfociti T sono un ramo del sistema immunitario adattativo caratterizzato dalla capacità di riconoscere efficientemente antigene peptide (Ag) vincolato al complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) molecole attraverso i recettori delle cellule T (TCR) ^1. Linfociti naïve costitutivamente migrano e Scan 'Ag cellule presentanti professionali »(APC, ad esempio, cellule dendritiche) all'interno dei linfonodi, mentre le cellule di memoria / T effettrici devono sorvegliare efficacemente una gamma estremamente ampia di APC e potenziali cellule bersaglio all'interno dei tessuti periferici.

Nel min seguente iscrizione iniziale delle cognate Ag su un APC, linfociti arrestare la loro migrazione e cominciano a formare un professionista intimo un'interfaccia cellula-cellula chiamato 'sinapsi immunologica' (IS). Sostenuta (cioè, 30-60 min) È contatti sono tenuti per amplificare e sostenere segnalazione ^2-7. Studi emergenti identificano che all'interno della IS, è la formazione continua e rapida remodeling di discrete segnalazione sub-cellulare micro-cluster (ad esempio, contengono MHC / Ag-TCR, F-actina, adesione e molecole di segnalazione), che determinano la forza e la qualità della conseguente risposta immunitaria ^2-7. Tuttavia, i dettagli dinamici e meccanismo di regolazione di questo processo non sono completamente compresi ^8,9. Ciò deriva in gran parte da problemi tecnici connessi con topologie irregolari di superfici APC e l'orientamento mal controllata dei piani di interazione cellula-cellula, i problemi che limitano profondamente imaging spazio-temporale richiesto avvicina ^8-10 (Figure1A).

Figura 1. Una fisiologica Planar APC cellulare Modello for Imaging immunologiche Synapse Dynamics. Lo schema mostra l'imaging tradizionale di sinapsi immunologica tra una cellula T e un professio nal APC (A) e cellule T e un modello tradizionale lipidico planare doppio strato APC (B) rispetto a questo romanzo endoteliale modello planare APC (C). APC professionali forniscono sinapsi immunologiche fisiologiche ma offrono interfaccia mal orientata cellula-cellula (cioè, rispetto al piano ottimale di imaging xy; risoluzione ~ 0,2 micron), che compromette notevolmente spaziale (piano di imaging z risoluzione ~ 1 micron) e temporale (cioè, a causa della necessità di eseguire la scansione ripetutamente attraverso tutti i piani di imaging z) Risoluzione di imaging. Modelli a doppio strato hanno una topologia planare che fornisce la risoluzione ottimale delle immagini spazio-temporale, ma sono anche molto semplificate, non fisiologica e rigida. Questo modello delle cellule endoteliali combina la topologia planare di doppi strati lipidici con il substrato fisiologico di un classico APC per fornire la risoluzione ottimale di imaging spaziale e temporale in un ambiente fisiologico.m / files / ftp_upload / 53288 / 53288fig1large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Il lavoro precedente ha parzialmente aggirato questi ostacoli attraverso lo sviluppo di modelli di substrato planare (ad esempio, doppi strati lipidici e superfici rivestiti con anticorpo) che forniscono la risoluzione spazio-temporale ottimale (cioè, mediante il fissaggio alla superficie di attivazione delle cellule T in un unico piano che è parallelo al di imaging ottimale xy piano) ^11-15 (Figura 1B). Questi modelli hanno facilitato importanti conoscenze sulle dinamiche subcellulari / molecolari che controllano la segnalazione antigenico nelle cellule T, tra cui la scoperta di actina dinamico / TCR segnalazione micro-cluster ^7,11-14. Tuttavia, tali modelli sono intrinsecamente avevano semplificato, così come rigida (precludendo sviluppo / studio delle caratteristiche topologiche 3-dimensionali) (Figura 1B). Pertanto, rimane incerto su come relazionarsi tali risultati al PHYsiologic cellula-cellula sorveglianza immunitaria.

Sebbene ancora poco studiato, vascolari e cellule endoteliali linfatiche stanno emergendo come un grande (vale a dire, maggiore in numero rispetto a tutti APC professionali, da ~ 1.000 volte) compartimento periferico di 'semi-professionale' APC ^16-18. Queste cellule esprimono MHC-I-, MHC-II e una moltitudine di molecole co-stimolatore (ad esempio, CD40, LFA3, ICOSL, 4-1BB, OX40L, TL1A, PD-L1, ma non CD80 e CD86) e sono strategicamente posizionato all'interfaccia sangue tessuto in cui servono le funzioni di sentinella specializzate ^16-18. Studi precedenti hanno dimostrato che le cellule endoteliali possono effettivamente ri-stimolare effettori / memoria, ma non ingenua, le cellule T ^19-25. Così, le cellule endoteliali sono suscettibili di svolgere ruoli unici APC in fase effettrice delle risposte immunitarie adattive all'interno dei tessuti periferici, come ad esempio l'influenza locale all'attivazione delle cellule T, la differenziazione, la memoria e la tolleranza ^16,17,26. Criticamente, quando coltivate in vitro, le cellule endoteliali formano superfici cellulari praticamente piane e sono immediatamente transfectable (ad esempio, con i reporter proteina fluorescente). Queste caratteristiche sono ideali per imaging ad alta risoluzione spazio-temporale delle dinamiche topologiche durante le interazioni cellula-cellula ^19,27. Così le cellule endoteliali potrebbe servire come 'cellulare planare APC' modello fisiologico distintamente adatto per lo studio dei meccanismi di rimodellamento sottocellulari / molecolare che guidano riconoscimento dell'antigene e regolano le risposte (Figura 1C) ^19,20.

Precedentemente stabilito tecniche di imaging complementari (comprese trasfezione di cellule endoteli con accessori proteina fluorescente della membrana plasmatica e citosol) per studiare i dettagli di interazione leucociti-endotelio durante adesione e migrazione transendoteliale ^27, hanno mostrato che i leucociti sondare attivamente superficie dell'endotelio dalla dinamica l'inserimento di und retrazione del sub-micron-scala, sporgenze cilindriche ricco di actina (~ 200-1.000 nm di diametro e profondità) definito invadosome-come sporgenze (vale a dire, 'ILPS') ^27,28. Questi approcci di imaging sono state ulteriormente espansa insieme alla creazione di protocolli di sfruttare funzione endoteliale APC per sviluppare i primi metodi per un'alta risoluzione spazio-temporale della cellula endoteliale sinapsi immunologica T come riportato ^19,20 e ulteriormente descrivere qui. Un risultato centrale derivato da questo romanzo planare cellulare modello APC è che ILPS cellule T funzionano sia nel promuovere il riconoscimento iniziale Ag e nel sostenere la successiva segnalazione. In effetti, gli array di più ILPS (che sono stati stabilizzati e maturati in risposta alla prima flusso di calcio) spettacolo di arricchimento in TCR e molecole suggestivi della segnalazione attiva tale PKC-Q, ZAP-70, phosphotyrosine e HS1. Pertanto, ILPS sembrano rappresentare un equivalente fisiologica tridimensionale al micro TCR segnalazionecluster visto in modelli doppio strato planari. Questo approccio, quindi, sensibilmente rivela / report dinamica molecolare e architettonici (e implicite biomeccanica) non altrimenti rilevabile.

Il metodo qui descritto dovrebbe essere utile per colmare il divario tra APC professionali e modelli substrato artificiale APC, al fine di migliorare la nostra capacità di interrogare meccanismi di base della risposta immunitaria adattativa. Mentre qui l'attenzione è sull'attivazione di CD4 ⁺ di tipo Th1 effettore / cella di memoria, questo approccio di base può essere facilmente modificato per studiare una vasta gamma di tipi di cellule T e Ags, come discusso di seguito.