Glioblastoma'nın için bir Immünkompetan Hayvan Modeli Biyoparlaklık Görüntüleme

Aşağıda açıklanan tüm prosedürler gözden geçirilecek ve Northwestern Üniversitesi Kurumsal Hayvan Kullanım ve Bakım Komitesi tarafından onaylanmış ve steril koşullar altında yapılmıştır oylandı. Ateşböceği Lusiferaz ifade Reporter GL261 1. Hücre modifikasyonu Not: HİV-1 tabanlı bir lentiviral vektörler dalak odaklama oluşturucu virüsü (SFFV) promoterinin kontrolü altında ateşböceği lusiferaz (Fluc) ifade etmektedir. Optik haberci gen vektör plasmidinin pHRSIN-CSGW-dlNotI içine klonlanmıştır. 95 ihtiva eden nemli bir atmosferde 37 ° C'de% 10 FBS ve% 1 penisilin-streptomisin ile takviye edilmiş RPMI ortamında% 10 fetal bovin serumu (FBS) ve GL261 hücreleri ile takviye edilmiş Dulbecco tadil edilmiş Eagle ortamı (DMEM) içinde 293-T hücrelerini korumak % hava ve% 5 karbon dioksit (CO2). 293-T hücre kültürü, bir T-75 balon içinde% 80 konfluent ulaştığında, pH ile bir kez yıkama hücreleriosphate tamponlu salin Ca2 + ve Mg2 + olmaksızın (PBS), bir şişe, hafif eğik tutarak, 5 ml pipet ile 5 dakika, öğüterek 37 ° C'de tripsin (% 0.05) ve 3 ml hücreleri inkübe ve hücreleri toplamak şişenin tabanından. 15 ml konik bir tüp içine tripsinize hücre süspansiyonu 3 ml transferi ve eti RPMI ortamı (hücre süspansiyonu, 10 ml toplam), 7 ilave edin. 5 ml'lik bir pipetten iyi bir hücre süspansiyonu karıştırın. Tüp hücre süspansiyonu 100 ul alın ve hemasitometre kullanarak hücreleri sayın. Bunu yapmak için, tripan mavisi çözeltisi 300 ul hücre süspansiyonu 100 ul karıştırın ve bir hemositometrede karışımın içine 2 ul yerleştirin. Mikroskop altında dört ayrı görünümler mavi lekelenme olmadan hücrelerin sayısını. Bu sayı 10 4 hücre / ml temsil gibi her görünümden hücre sayısını ortalama. Bu arada, 30 ° C'de bir hücre süspansiyonu ihtiva eden tüp santrifüj7 dakika için 0 xg. Ortamı aspire ve 1.0 x 10 6 / ml yoğunlukta GL261 hücre süspansiyonu yapmak için taze RPMI ortam maddesi ile hücre pelletleri tekrar süspansiyon. 27,5 ml DMEM (gün 1), bir T-175 şişesi içine RPMI ortamı 2,5 ml tohum 2.5 x 10 6 GL261 hücreleri. 24 saat sonra, 20 ml taze DMEM (gün 2) ile orta değiştirin. , Lentiviral vektör üretmek 5 dakika boyunca 2 ml serum serbest DMEM ile 54 ul transfeksiyon ayıracı karıştırmak için. Transfeksiyon reaktifi ile DMEM içinde Fluc (pSIN-Fluc) 3 gag-pol ug, veziküler stomatit virüsü G zarf (VSV-G) 3 ug ve 4.5 ug ekleyin ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edilir. 293-T şişeye (T-175), içine tüm bir DNA karışımı damla ve 48 saat (Gün 2)% 95 hava ve% 5 CO2 içeren nemli bir oda içinde 37 ° C'de inkübe edin. (3 gün) (yaklaşık 30 ml olmalıdır 293-T hücre kültür ortamında toplam hacmine) transfeksiyon sonrası 24 saat sonra, taze DMEM 10 ml ekleyin. Bir içine GL261 hücreleri bölmek için24-çukurlu plaka, hafif eğik bir balon tutarak, 5 ml pipet ile 5 dakika, öğüterek 37 ° C'de tripsin (% 0.05) ve 5 ml hücreleri inkübe Ca2 + ve Mg2 + olmaksızın PBS ile bir kez yıkama hücreleri , şişenin dibine kadar tüm hücreleri toplamak ve adım 1.2 gibi hemasitometre yoluyla hücreleri saymak. Bu arada, 7 dakika boyunca 300 xg'de tüp santrifüj. Ortamı aspire ve 2.5 x 10 4 / ml yoğunlukta GL261 hücre süspansiyonu yapmak için taze RPMI ortam maddesi ile hücre pelletleri tekrar süspansiyon. Tohum 24 oyuklu bir plaka içerisinde RPMI ortam 1 ​​ml (3 gün) 2.5 x 10 4 GL261 hücreleri. 48 saat aşağıdaki transfeksiyonu 293-T şişesi (T-175) 10 ml pipet ile lentiviral süpernatant 30 ml toplayın ve 50 ml konik tüp içine süpernatant aktarın. Aspire 30 ml lentiviral 0.22 um'lik bir şırınga filtreden geçirilerek 50 ml şırınga ile yüzer madde, ve 1 ml alikotları (gün 4), viral supernatant kısım. R 1 ml değiştirinLentiviral süpernatan 1 ml ile GL261 hücre plakasına (24-çukurlu) PMI ortamı nemli bir bölmede (gün 4), 37 ° C'de inkübe edin. Lentiviral enfeksiyonun 48 saat sonra, taze, RPMI 1 ml (gün 6) ile orta değiştirin. 24 saat sonra, GL261 hücreleri (gün 7) lentiviral enfeksiyonu tekrarlanır. Lentiviral enfeksiyonun 2. 48 saat sonra, taze, RPMI 1 ml (gün 9) ile orta değiştirin. (GL261.luc hücreleri olarak ifade edilecek olan), lusiferaz değiştirilmiş GL261 hücrelerin büyümesine ve T-75 balonuna hücre kültürü genişletmek için devam edin. GL261.luc hücre kültürü, bir T-75 balon içinde% 70 ortak akışkanlığa ulaştığında, tripsinizasyon ile hücreler hasat ve adım 1.2 olarak hemositometre ile sayılır. Mezun yoğunluklarda bir 24-yuvalı plaka içine GL261.luc hücre plakası (1.0 x 10 6 5.0 x 10 5, 2.5 x 10 5, 1.0 x 10 5, 5.0 x 10 4, 2.5 x 10 4 hücre / çukur) ve Bir humidi 37 ° C'de inkübe3 saat boyunca bir% 95 hava ve% 5 CO2 içeren ğı odası. Hücresel lusiferaz aktiviteye ölçün biyolüminesans görüntüleme (Şekil 1) kullanılarak, U-87 MG (U87.luc) hücreler modifiye edilmiş lusiferaz için. Görüntü yazılımı başlatın (masaüstünde simgesini tıklatın) ve görüntüleme sistemi başlatmak (tıklayın lütfen "Başlatma"). Başlatma otomatik olarak başlayacak ve sistem check-up ve -90 ° C'ye kadar soğumasını kamera için birkaç dakika sürebilir. Her kuyuya 25 ul luciferase (D-Lusiferin, potasyum tuzu, 150 mg / kg) ekleyin. 10 sn için plaka, oda sıcaklığında 1 dakika boyunca luciferase ve görüntü kuluçkaya bırakılır. Görüntüleme sistemi kurmak için, "Lüminesans", "10 sn" maruz kalma süresi ve "Orta" binning seçin. Görüntüleme istasyonunda 24-plaka koyun ve görüntüyü başlatmak için "Acquire" düğmesini tıklayın. Görüntü başarıyla elde edildikten sonra, bir görüntü penceresi ve takım pa göreceksinizEkranda lette. "ROI (ilgilenilen bölgeleri) Araçlar" ı tıklayın ve yarık simgesinden 6 x 4 seçeneğini belirleyin. 24 plaka görüntü üzerinde sinyal alanı kapsayacak ve ölçümler sekmesini (kalem simgesi) tıklayın 6 x 4 yırtmaçlı oluşturun. Cm kare (fotonlar / sn / / sr cm2) başına steradyan'dır saniyede fotonların birimi olarak ROI ölçümleri bir tablo ile bir pencere gözlemleyin. Kullanım U87.luc hücreleri, daha önce kalıt GL261.luc hücrelerde lusiferaz aktivitesinin değerlendirilmesi için bir kontrol olarak, GL261 modifikasyonu 11 burada kullanılan aynı lentivirüs ile değiştiirlmiştir. In Vitro Proliferasyon Tahlili 2. GL261 ve GL261.luc hücre kültürleri, bir T-75 balon içinde% 70 ortak akışkanlığa ulaştığında, tripsinizasyon ile hücre çizgileri, her iki hasat ve aşama 1.2'de olarak kabul ve 1500 hücre yoğunluğunda bir 96-çukurlu plaka içinde plaka hücreleri iyi zaman ve pipetleme hataları en aza indirmek için çok kanallı pipet kullanarak başına RPMI ortamında 80 ul. Seed 20 kuyu toplam içine her bir hücre çizgisi. Hücreler tarafından doldurulan kuyularda buharlaşma sınırlamak için taze RPMI ortamında 100 ul ile boş kuyu doldurun. Kolorimetrik hücre çoğalma analizi kullanılarak hücre çoğalmasını değerlendirin. Burada MTS hücre proliferasyon deneyi kullanmaktadır. Bir çok kanallı pipet kullanarak, hücreleri içeren 96 oyuklu plakanın her bir oyuğuna, MTS reaktifi 20 ul ekle. 3 saat boyunca bir% 95 hava ve% 5 CO2 içeren nemli bir oda içinde 37 ° C 'de plaka inkübe edin. Bir mikrolevha okuyucu kullanılarak 490 nm'de absorbansı ölçülür. Bu kaplama sonrası, 7 gün 1, 2, 4 tekrarlanan, ve. Absorbans değerlerini normalize etmek için, her gün değerleri günde 1 (Şekil 2) elde edilen karşılık gelen okumaları ile bölünür. 3. Tümör Hücre İmplantasyonu Not: Tüm ekipman Otoklav. Bir dezenfektan (% 2 klorheksidin solüsyonu) püskürtülerek cerrahi alan hazırlayın ve absorben ile kapakt perdeler. Steril koşullar korumak ameliyat sırasında steril cerrahi eldiven giyin ve renk bantla iki bölüme cerrahi alan bölmek için. Alan 1 "Temiz" etiketli ve sterilize malzemeleri içerir; Alan 2 "Kirli" etiketli ve malzemeler kullanılır içerir. Hayvan Ameliyat öncesinde, intrakranyal enjeksiyon için bir hücre süspansiyonu hazırlamak. % 70 birbirine bağlı T-75 şişe tripsinizasyon ile ve adım 1.2 olarak hemasitometre ile hücre sayımı ve Ca2 + olmadan Hanks Dengelenmiş Tuz Çözeltisi içinde 1.0 x 10 5 hücre / ul bir yoğunlukta bir hücrelik bir süspansiyon hazırlamak ve Hasat hücreleri Mg + 2 (HBSS). % 0.9 salin içinde ksilazin ketamin 100 mg / kg ve 10 mg / kg ihtiva eden 200 ul karışımın peritoneal içi enjekte olan fareler anestezi. Uygun anesthetization onaylamak için, farenin ayak tutam. Fare tamamen anestezi altında, fare uyarıcıya cevap olmamalıdır. 0.1 m yönetmederi altı enjeksiyon yoluyla g / kg buprenorfın post-operatif ağrı gidermek için. % 2 klorheksidin solüsyonu batırılmış bir pamuk uçlu aplikatör ile makası ve temiz kullanan hayvanların başının üst Tıraş. Ameliyat sırasında yeterli yağlama sağlamak için göz merhemi sürün. Steril bir neşter kullanılarak parieto-oksipital kemiğin üzerinde yaklaşık 1 cm uzunluğunda sagittal bir kesi yapılmalıdır. Bregma görselleştirmek için,% 3 hidrojen peroksit çözeltisi batırılmış bir pamuk uçlu aplikatör ile kafatası yüzeyi silin. Bregma sağ ve sadece koronal sütür arkasında küçük bir delik 3 mm yapmak için steril 25-G iğne ile kafatası delin. Intrakranial enjeksiyon sahası kafatası 3 mm'lik bir derinliğe kadar olduğundan emin olmak için, makas kullanılarak 20 ul pipet ucu sivri ucunda 3 mm kesilmiş ve pipet bir şırınga içine yerleştirin. Önceden oluşturulan deliğe dik şırınga takın ve yavaşça tümör hücresi enjekte sus1 dakikalık bir süre boyunca 3 ul HBSS 3.0 x 10 5 hücreleri içeren emeklilik. Bir dakika yerinde iğne bırakın ve sonra yavaşça iğneyi çekin. % 3 hidrojen peroksit batırılmış pamuk uçlu aplikatörü ve% 2 klorheksidin çözeltisi ile kafatası bez. Pamuk uçlu aplikatör ile kafatası yüzeyi kurulayın. Boyutunda 3 yaklaşık 3 mm steril kemik mum kesip ve pamuk uçlu aplikatörü uç tarafındaki kemik mumu takın. Pamuk uçlu aplikatör ile deliği örtmek için kemik mumu uygulayın. Forseps kullanarak kafatası üzerinde birlikte kafa derisinde her tarafını çizin ve zımba yarayı kapatmak için. % 2 klorheksidin solüsyonu batırılmış bir pamuk uçlu yara temizleyin. Onlar ayakta hale gelene kadar ameliyat sonrası tüm fareleri Monitör ve normal aktiviteye saklayın. Tipik olarak, iyileşme süresi yaklaşık 30 dakikadır. Tam anestezi kurtarıldı kadar diğer hayvanlarla birlikte kafes fareler iade etmeyin. <p class = "jove_title"> 4. GL261 Tümör Büyüme Biyoparlaklık Görüntüleme Temiz bir kağıt havlu üzerine dezenfektan bol miktarda (% 0.05 dimetil amonyum klorür çözeltisi) püskürtün. İyice hayvanlar cihaz ile temas halinde olacak görüntüleme odasının içine siyah levha, burun konileri ve bölücü silmek için dezenfektan batırılmış kağıt havlu kullanın. İyice temiz, kuru bir kağıt havlu ile tüm yüzeyleri silin. Bu kez daha tekrarlayın ve 5 dakika bekleyin. Adım 1.14.1 gibi görüntüleme istasyonu başlatılamıyor. Intraperitoneal enjeksiyon ile ketamin / ksilazin 200 ul ve 100 ul luciferase (D-Lusiferin, potasyum tuzu, 150 mg / kg) ihtiva eden bir 300 ul karışımı ile fare anestezisi. Enjeksiyondan sonra 10 dakika bekleyin ve fareler kuyruk kısma anestezi altında tamamen onaylamak. Görüntüleme sistemi kurmak için, "Lüminesans", "Otomatik" maruz kalma süresi ve "Orta" binning seçin. Görüntüleme stati fareler yerleştirinve görüntüyü başlatmak için "Acquire" düğmesini tıklayın. Enjeksiyondan sonra zaman her görüntüleme oturumu ile tutarlı olduğundan emin olun. Görüntü başarıyla elde edildikten sonra, bir görüntü penceresi ve araç paleti görünmelidir. "ROI Araçlar" tıklayın ve daire simgesinden "auto" seçeneğini seçin. İB'leri tanımlamak için resmin üzerine sinyal alan kuşatmak ve daha sonra sr fotonlar / sn / / cm 2 birimi olarak ROI ölçümleri almak. Görüntüleme odasının dışına fareler alın ve onlar ayakta olana kadar fareler izlemek ve normal aktiviteye saklayın. Genellikle iyileşme süresi yaklaşık 15 dakikadır. Tam anestezi kurtarıldı kadar diğer hayvanlarla birlikte kafes fareler iade etmeyin. Hayvanlar, aşağıdaki semptomlar ile kadar haftada iki kez biyolüminesans görüntüleme tümör büyümesini izlemek: kilo kaybı (emplantasyondan önce ağırlık% 20'den fazla göreli kaybı), iştahsızlık (24 saat süre ile tam bir anoreksi) ve sürekli purposefu eksikliğionlar ötenazi gerektiğini hangi zaman nazik uyaranlara (kalkmak zayıf girişimi), l tepki. Servikal dislokasyon bir CO2 odası kullanılarak, bu belirtileri olan hayvanlar öldürülür. Yer ötenazi odasına fareler (kalabalık odasına yapmak) ve girişi 5-6 dakika CO 2 sıkıştırılmış. Tüm hayvanlar bilinçsizlik ve sonra yaklaşık 5 dakika nefes olmadığını gözlemleyin. Odasından dışarı fareler alın. Kalp Başparmak ve işaret parmağı arasında göğüs hissederek yenerek olmadığından emin olun ve hiçbir göz kırpma refleksi olup olmadığını kontrol edin. Düz bir yüzeye yüzükoyun pozisyonda fare kısıtlamaktadır ve baş parmağınız ve diğer yandan ilk parmağı ile kuyruk tek elle kafatası tabanındaki ensesini ve taban kavramak. Kafa dizginlemek ve hızlı bir şekilde geriye kuyruk çekin. Bu kafatası başparmağınızı ve ilk parmak kullanarak ilk servikal omur ayrılır olun. Normadım 2.3 (Şekil 3A) olarak biyolüminesans görüntüleme ilk gününde elde edilen karşılık gelen okumaları karşı her gün için alize lüminesans değerleri. İstatistiksel analiz için Kaplan-Meier tahmincisi 12 kullanılarak sağkalım eğrileri oluşturmak ve bir log-rank testi 13 kullanılarak sağkalım eğrileri arasındaki farklılıkları karşılaştırmak.