Биолюминесценция изображений из иммунокомпетентных животной модели для глиобластомы

Все процедуры, описанные ниже, были рассмотрены и одобрены Институциональные использования животных и ухода комитета при Северо-Западном университете и были выполнены в соответствии с стерилизованных условиях. 1. Изменение GL261 клеток с Светлячок люциферазы выражая Reporter Примечание: ВИЧ-1 на основе лентивирусов векторов выражают люциферазы светлячка (Fluc) под контролем селезенки внимание образующего вируса (SFFV) промотора. Ген оптического репортер был клонирован в вектор плазмиды pHRSIN-CSGW-dlNotI. Поддержание 293-Т-клеток в модифицированной среде Дульбекко Игла (DMEM), дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и GL261 клеток в RPMI среде, дополненной 10% FBS и 1% пенициллина-стрептомицина при 37 ° С в увлажненной атмосфере, содержащей 95 % воздуха и 5% углекислого газа (CO 2). Когда культура 293-Т-клеток достигает 80% слияния в Т-75 колбу, промыть клетки один раз телosphate буфера солевым раствором (PBS), без Са2 + и Mg2 +, инкубировать клетки с 3 мл трипсина (0,05%) при 37 ° С в течение 5 мин, измельченного в порошок с 5 мл пипетки, удерживая колбу слегка наклонно и собрать все клетки из нижней части колбы. Перенести 3 мл клеточной суспензии трипсином в 15 мл коническую трубку, и добавить 7 мл RPMI среде плоти (в общей сложности 10 мл клеточной суспензии). Смешайте клеточной суспензии и с 5 мл пипетки. Возьмите 100 мкл клеточной суспензии из трубы и подсчитать количество клеток с использованием гемоцитометра. Для этого смешайте 100 мкл клеточной суспензии с 300 мкл трипанового синий раствор и вставьте 2 мкл смеси в гемоцитометра. Подсчитайте количество клеток без голубого окрашивания от четырех отдельных видах под микроскопом. Нормальное количество клеток из каждой точки зрения, так как это число представляет 10 4 клеток / мл. Между тем, центрифугирование трубки, содержащей суспензию клеток на 300 мкг в течение 7 минут. Аспирируйте СМИ и ресуспендирования ячейки гранул со свежим RPMI среде, чтобы сделать GL261 клеточной суспензии при плотности 1,0 х 10 6 / мл. Семенной 2,5 х 10 6 GL261 клетки с 2,5 мл RPMI СМИ в колбу Т-175 с 27,5 мл DMEM (1 день). Через 24 часа, замените носитель с 20 мл свежего DMEM (день 2). Для получения вектора лентивирусов, смешать 54 мкл реагента для трансфекции с 2 мл бессывороточной среды DMEM в течение 5 мин. Добавить 3 мкг затычки-Pol, 3 мкг вируса везикулярного стоматита G оболочки (VSV-G), и 4,5 мкг Fluc (pSIN-Fluc) в среде DMEM с реагента для трансфекции, и инкубируют в течение 20 мин при комнатной температуре. Отбросьте всю смесь ДНК в 293-Т колбу (трет-175) и инкубируют при 37 ° С во влажной камере, содержащей 95% воздуха и 5% CO 2 в течение 48 ч (день 2). Добавьте 10 мл свежего DMEM в 24 ч после трансфекции (общий объем клеточной культуральной среды 293-Т должна быть примерно 30 мл) (3 день). Чтобы разделить GL261 клетки в24-луночный планшет, промыть клетки один раз ЗФР без Са2 + и Mg2 +, инкубировать клетки с 5 мл трипсина (0,05%) при 37 ° С в течение 5 мин, измельченного в порошок с 5 мл пипетки, удерживая колбу слегка наклонены , собрать все клетки из нижней части колбы, и клетки рассчитывать через гемоцитометра, как на стадии 1.2. Между тем, центрифугировать пробирку при 300 х г в течение 7 мин. Аспирируйте СМИ и ресуспендирования ячейки гранул со свежим RPMI среде, чтобы сделать GL261 клеточной суспензии при плотности 2,5 х 10 4 / мл. Семя 2,5 х 10 4 клеток GL261 с 1 мл RPMI СМИ в 24-луночного планшета (день 3). Сбор 30 мл лентивирусов супернатанта с помощью 10 мл пипетки из колбы 293-Т (Т-175) на 48 ч после трансфекции и передачи супернатант в 50 мл коническую трубку. Аспирируйте 30 мл лентивирусов супернатант с помощью 50 мл шприца, через шприцевой фильтр 0,22 мкм, и аликвоту супернатанта вируса в 1 мл аликвоты (4 день). Замените 1 мл RPMI среднего GL261 клеток пластины (24-луночные) с 1 мл супернатанта лентивирусов и инкубировать при 37 ° С во влажной камере (4 день). После 48 ч в лентивирусов инфекции, заменить жидкость с 1 мл свежей RPMI с (6 день). Через 24 часа, повторить лентивирусов инфекцию GL261 клеток (7 день). После 2-го 48 ч лентивирусных инфекции, заменить жидкость с 1 мл свежей RPMI с (9 день). Продолжают расти люциферазы модифицированный GL261 клетки (которые будут называться GL261.luc клеток) и расширить культуры клеток к Т-75 колбу. Когда культура GL261.luc клеток достигает 70% слияния в Т-75 колбу, урожай клеток трипсинизацией и рассчитывать на гемоцитометра, как в шаге 1.2. Пластина ячейку GL261.luc в 24-луночного планшета на выпускников плотностей (1,0 х 10 6, 5,0 х 10 5 2,5 х 10 5 1,0 х 10 5 5,0 х 10 4 2,5 х 10 4 клеток / лунку) и инкубировать при 37 ° С в увлажняемомFied камеру, содержащую 95% воздуха и 5% CO 2 в течение 3 ч. Измерьте сотовой активность люциферазы по отношению к люциферазы модифицированный U-87 MG (U87.luc) клеток с использованием биолюминесценции томография (рисунок 1). Запустите программу изображения (нажмите значок на рабочем столе) и инициализации системы визуализации (нажмите кнопку "Initialize"). Инициализация начнется автоматически и может занять несколько минут для системы проверки и камеры для охлаждения до -90 ° C. Добавить 25 мкл люциферин (D-люциферин калиевой соли, 150 мг / кг) в каждую лунку. Инкубируйте клетки с люциферин в течение 1 мин при комнатной температуре и изображения пластины в течение 10 сек. Чтобы настроить систему визуализации, выберите "люминесцентных", "10 сек" время экспозиции, и «средний» биннинга. Поместите 24-луночного планшета на изображения станции и нажмите кнопку "Снимок", чтобы начать изображение. После того как изображение будет успешно приобрела, вы увидите окно изображения и инструмент годовыхLette на экране. Нажмите "ROI (области интереса) Инструменты» и выберите 6 х 4 с помощью значка щели. Создать 6 х 4 щели, чтобы покрыть площадь сигнала на изображении пластинки 24-а и щелкните вкладку измерений (значок карандаша). Соблюдайте окно с таблицей измерений ROI в качестве единицы фотонов в секунду на стерадиан на квадратный см (фотонов / сек / SR / см 2). Использование U87.luc клетки, предварительно модифицированный же лентивирусов, используемого здесь модификации GL261 11, в качестве контроля для оценки активности люциферазы в клетках GL261.luc трансдуцированных. 2. Экстракорпоральное пролиферации Когда клеточные культуры GL261 и GL261.luc до 70% слияния в Т-колбе 75, урожай Обе клеточные линии обработкой трипсином и подсчитать, как на стадии 1.2, и пластинчатые элементы в 96-луночный планшет при плотности 1500 клеток на 80 мкл RPMI среде в хорошо используя многоканальную пипетку, чтобы свести к минимуму время и ошибки пипетирования. Серед каждая клетка линия в общей сложности 20 скважин. Чтобы ограничить испарение в лунках населенных клеток, заполнения пустых лунок 100 мкл свежей RPMI среде. Оценка клеточной пролиферации с использованием колориметрического анализа клеточной пролиферации. Здесь мы используем клеточной пролиферации МТС. Используя пипетку многоканальный, добавить 20 мкл МТС реагента в каждую лунку 96-луночного планшета, содержащего клетки. Инкубируйте планшет при 37 ° С во влажной камере, содержащей 95% воздуха и 5% CO 2 в течение 3 ч. Измерить поглощение при 490 нм с использованием микропланшет-ридера. Это повторяется в дни 1, 2, 4 и 7, после посева. Для нормализации значения абсорбции, значения каждый день делятся на соответствующие показания, полученные в 1-й день (рис 2). 3. имплантации опухолевых клеток Примечание: Автоклав все оборудование. Подготовка хирургического области путем распыления дезинфицирующего (2% раствор хлоргексидина) и накрыть absorbenт. драпировки Для того, чтобы поддерживать стерильные условия, носить стерильные хирургические перчатки во время операции, и разделить хирургическое площадь в двух областях по цвету ленты. Площадь 1 помечен "Чистый" и содержит стерилизованные поставок; Область 2 помечен "Грязные" и содержит использованы материалы. До операции животных, подготовить клеточную суспензию для инъекций внутричерепного. Урожай клетки от 70% сливной Т-75 колбу обработкой трипсином и подсчитать клетки через гемоцитометра, как на стадии 1.2, и сделать клеточную суспензию при плотности 1,0 × 10 5 клеток / мкл в Хэнкса сбалансированном солевом растворе без Ca 2+ и Mg 2+ (HBSS). Обезболить мышей интраперитонеальной инъекции 200 мкл смеси, содержащей 100 мг / кг кетамина и 10 мг / кг ксилазина в 0,9% физиологическом растворе. Чтобы подтвердить надлежащее обезболивание, щепотка палец мыши. Если мышь находится полностью под наркозом, мышь не должна реагировать на раздражитель. Администрирование 0,1 мг / кг бупренорфин с помощью подкожных инъекций, чтобы облегчить послеоперационную боль. Бритье верхней части головы животных с использованием машинки для стрижки и чистый с хлопком наконечником аппликатором, смоченным в 2% -ном растворе хлоргексидина. Применить глазную мазь, чтобы поддерживать необходимую смазку во время операции. Сделайте надрез сагиттальной длиной около 1 см от теменно-затылочной кости, используя стерильным скальпелем. Для визуализации брегмы, протрите поверхность черепа с хлопка наконечником аппликатора, смоченной в 3% растворе перекиси водорода. Дрель череп со стерильным 25-G иглы, чтобы сделать небольшое отверстие 3 мм справа от темени и просто за венечного шва. Чтобы гарантировать, что внутричерепное месте инъекции на глубину 3 мм от черепа, сократить 3 мм ОТ заостренным концом пипетки 20 мкл с помощью ножниц и вставить шприц в пипетки. Вставьте шприц перпендикулярно к отверстию созданной ранее и медленно вводить опухолевых клеток SUSпенсии, содержащий 3,0 × 10 5 клеток в 3 мкл HBSS, в течение 1 мин. Оставьте иглу на месте в течение другой минуты, а затем медленно вытяните иглу. Тампон череп с хлопком-наконечника аппликатора, смоченным в 3% перекиси водорода и 2% раствором хлоргексидина. Высушите поверхность черепа с хлопка наконечником аппликатора. Вырезать из стерильной кости воск приблизительно 3 мм 3 в размере и прикрепить кости воск на торцевой стороне хлопка-наконечника аппликатора. Нанесите воск кости, чтобы покрыть отверстие с хлопка наконечником аппликатора. Нарисуйте каждую сторону головы вместе над черепом с помощью щипцов, и главный, чтобы закрыть рану. Очистите рану ватным кончиком, смоченным в 2% -ном растворе хлоргексидина. Контроль всех мышей после операции, пока они не станут амбулаторно и сохранить нормальную деятельность. Как правило, время восстановления составляет приблизительно 30 мин. Не вернуть мышей в клетку с другими животными, пока они не полностью оправился от наркоза. <p cдевушка = "jove_title"> 4. Биолюминесценция Визуализация GL261 опухолевого роста Спрей щедрое количество дезинфицирующего средства (0,05% раствор диметил хлорида аммония) на чистую бумажным полотенцем. Используйте дезинфицирующее пропитанной бумажной салфеткой, чтобы вытереть тщательно черный лист, конусы и делитель внутри изображения камеры, где животные будут находиться в контакте с устройством. Тщательно протрите все поверхности чистой сухой бумажной салфеткой. Повторите это еще раз и ждать 5 мин. Инициализация изображения станцию, как в шаге 1.14.1. Обезболить мышь с 300 мкл смеси, содержащей 200 мкл / ксилазина Кетамин и 100 мкл люциферин (D-люциферин калиевой соли, 150 мг / кг) путем внутрибрюшинной инъекции. Подождите 10 минут после инъекции и подтвердить, если мышей полностью под наркозом, зажимая хвост. Чтобы настроить систему визуализации, выберите "Люминесцентные", "Auto" время экспозиции, и «средний» биннинга. Поместите мышей на стати изображений, и нажмите кнопку "Снимок", чтобы начать изображение. Убедитесь, что время после инъекции согласуется с каждой сессии изображений. После того как изображение будет успешно приобрела, должно появиться окно изображения и палитра инструментов. Нажмите кнопку "ROI Инструменты" и выберите "Auto" в виде круга. Чтобы определить трансформирования, окружить площадь сигнала на изображении, а затем проводить измерения ROI в качестве единицы фотонов / сек / SR / см 2. Возьмите мышей из изображения камеры и контролировать мышей, пока они не стали, передвигающихся и сохранить нормальную деятельность. Обычно время восстановления составляет приблизительно 15 мин. Не вернуть мышей в клетку с другими животными, пока они не полностью оправился от наркоза. Монитор роста опухоли визуализации биолюминесценции два раза в неделю, пока животные не представляют следующие симптомы: потеря веса (потеря более 20% по отношению к весу до имплантации), отсутствие аппетита (анорексия полная в течение 24 часов), а также отсутствие устойчивого purposefuл ответ на нежной стимулов (слабая попытка встать), и в это время они должны быть умерщвлены. Эвтаназии животных с этими симптомами с использованием СО 2 камеры с последующим смещением шейных позвонков. Место мышей в камере эвтаназии (не переполнены камеры) и приток сжатого CO 2 в течение 5-6 мин. Заметим, что все животные сознания и не дышит примерно через 5 мин. Возьмите мышей из камеры. Убедитесь, что сердце не бьется, чувствуя грудь между большим и указательным пальцами и убедитесь, что нет мигают рефлекс. Задержите мышь в положении лежа на плоской поверхности и понять затылок в основании черепа с одной стороны, и основания хвоста с большим и указательным пальцами другой руки. Задержите голову и быстро вытащить хвост назад. Убедитесь, что череп отделяется от первого шейного позвонка, используя ваш большой палец и первый палец. НормаAlize значения люминесценции на каждый день от соответствующих показаний, полученных в первый день съемки биолюминесценции как на этапе 2.3 (фиг.3А). Для статистического анализа, генерации кривых выживаемости, используя Kaplan-Meier оценивания 12 и сравнить различия между кривыми выживаемости с использованием лог-рангового 13.