GL261 glioma cells provide a useful immunocompetent animal model of glioblastoma. The goals of this protocol are to demonstrate proper techniques for monitoring intracranial tumor growth using in vivo bioluminescence imaging, and to verify the utility of luciferase-modified GL261 cells for studying tumor immunology and immunotherapeutic approaches for treating glioblastoma.
In contrast to commonly reported human glioma xenograft animal models, GL261 murine glioma xenografts recapitulate nearly all relevant clinical and histopathologic features of the human disease. When GL261 cells are implanted intracranially in syngeneic C57BL/6 mice, the model has the added advantage of maintaining an intact immune microenvironment. Stable expression of luciferase in GL261 cells allows non-invasive cost effective bioluminescence monitoring of intracranial tumor growth. We have recently demonstrated that luciferase expression in GL261 cells does not affect the tumor growth properties, tumor cell immunomodulatory cytokine expression, infiltration of immune cells into the tumor, or overall survival of animals bearing the intracranial tumor. Therefore, it appears that the GL261 luciferase glioma model can be useful in the study of novel chemotherapeutic and immunotherapeutic modalities. Here we report the technique for generating stable luciferase expression in GL261 cells and how to study the in vitro and in vivo growth of the tumor cells by bioluminescence imaging.
Malignant glioma is the most common and most lethal human brain tumor. Even when treated with maximal surgical resection, radiotherapy, and chemotherapy, median survival remains 15-20 months at major brain tumor referral centers1, 2, 3. The most aggressive form of malignant glioma, glioblastoma, is characterized by mitotic figures, neovascularization, invasion into adjacent brain, and pseudopalisading necrosis. Orthotopic brain tumor xenografts using human brain tumor cells have served an essential function in neuro-oncology research and facilitated pre-clinical translation for testing of new agents, prior to entry into human clinical trials. Whereas most of human xenograft models recapitulate many features of the human disease, a fundamental limitation with all human-based xenograft model systems is the use of immunodeficient animals4.
The absence of an intact host response clearly modifies tumor growth both in terms of tumor morphology, and efficiency of engraftment. While certain assumptions are acceptable in the interpretation of results from xenografted models, achieving relevant conclusions in the area of therapeutic assessment is a challenge. Certain fundamental biologic features are likely to be similar in immunodeficient and immunocompetent animals, but others such as tumor associated inflammation, tissue invasion, response to injury are probably very different. In contrast, GL261 is a chemically induced murine glioma cell line that accurately recapitulates glioma when implanted into the brains of immunocompetent syngeneic C57BL/6 mice5. Similar to the human disease, intracranial tumor growth rapidly and reproducibly leads to neurologic symptoms and animal demise6-10.
Subcutaneous tumor growth can be directly measured. Intracranial tumor growth can only be measured with animal sacrifice or with costly imaging studies. Stable expression of the enzyme luciferase allows non-invasive and cost-effective intracranial bioluminescence imaging11. Bioluminescence of luciferase transfected GL261 cells correlates well with intracranial tumor growth. We have recently directly compared GL261 to luciferase modified GL261 cells and demonstrated no difference in in vitro growth and invasion, immunologic cytokine profile, in vivo survival of intracranial tumor bearing C57BL/6 mice, or immune cell infiltrate. This technique is applicable to glioblastoma preclinical studies which involve non-invasive monitoring of tumor growth.
GL261 células de glioma de murino, quando implantadas intracranianamente em imunocompetentes singeneicos C57BL / 6, oferecem várias vantagens em relação aos modelos de glioma de xenoenxerto em animais humanos. Muitos tumores de xenoenxerto cresce como lesões encapsuladas que não recapitulam exacta da doença humana invasiva. Em contraste, tumor GL261 não só demonstra invasão cerebral adjacente, mas também a neovascularização, figuras mitóticas, necrose 7 e profunda. O mais importante quando se estuda imunologia tumor ou estratégias imunoterapêuticas 15, 16, a C57BL / 6 do mouse mantém um sistema imunológico intacto 8. Estudos anteriores demonstraram expressão robusta da citoquina imunossupressora de TGF-β e tumores intracranianos contêm células T-reguladoras imunossupressores semelhantes ao glioblastoma humano 9, 10.
A técnica simples descrito aqui permite a expressão estável de luciferase por células GL261. Nós recentemente relataram simiLar de vitro e in vivo o crescimento de células em comparação com as células GL261.luc GL261, para além das características histológicas semelhantes de tumor e células imunitárias infiltrar 17. Células GL261.luc expressar estavelmente luciferase, que catalisa a oxidação do substrato luciferina converter energia química em fotões de luz e portanto detectável. Luciferina pode ser administrado com segurança a animais e atravessa a barreira hemato-encefálica após injecção intraperitoneal ou intravenosa. Em pequenos animais de pesquisa, tais como murganhos, a bioluminescência podem ser detectados externamente de forma não-invasiva 11. Portanto, o crescimento do tumor pode ser avaliada em série, sem a necessidade de sacrifício do animal ou dispendiosa imagiologia MRI ou CT.
Os passos críticos no protocolo envolvem, não só a transdução de lentivírus, mas também a verificação da expressão estável de luciferase in vitro antes de iniciar quaisquer experiências in vivo. Perda de transdução pode require infecção por lentivírus de repetição. Introdução de um gene de resistência a antibiótico no vector de expressão também pode ser utilizado para seleccionar para expressão da luciferase. Técnica meticulosa é necessária para a implantação intracraniana de colocar de forma reprodutível um número consistente de células numa localização anatómica precisa para permitir a comparação de grupos de tratamento diferentes. Uma das principais diferenças entre o presente estudo e estudos anteriores de células que expressam luciferase GL261 é a utilização de uma técnica de mão livre para a implantação de células em comparação com a utilização de uma moldura estereotáxica 18. Temos anteriormente demonstrado resultados consistentes com a implantação técnica de mão livre 19. A vantagem da técnica de mão livre é a capacidade de realizar análises de alto rendimento de agentes de tratamento diferentes. Em nossas mãos, nós podemos implantar cerca de 60 animais em 1 hora.
Depois de dominar a técnica, as futuras aplicações da técnica são ilimitadas. Como GL261 demonstrates elevados mitoses e o crescimento rápido do tumor semelhante ao glioblastoma humano, os tratamentos anti-proliferativos podem ser avaliadas. Do mesmo modo, as terapias anti-invasivas e anti-angiogénicas podem ser utilizadas como os tumores GL261 são invasivos e angiogénico. O cuidado deve ser usado para avaliar o efeito de agentes quimioterápicos que visam alvos humanos. Em comparação com estudos anteriores utilizando xenoenxertos de glioblastoma humano que expressam luciferase 20, isso seria considerado uma limitação do nosso modelo. Além disso, o efeito de estratégias imunoterapêuticas de crescimento do tumor podem ser estudados no modelo de xenoenxerto GL261.
The authors have nothing to disclose.
We would like to thank Rajwant Kaur for technical assistance. We would like to thank Maxwell Tom for assistance with lentivirus preparation. This work was supported by the Reza and Georgianna Khatib Endowed Chair in Skull Base Tumor Surgery at UCSF, and the Michael J. Marchese Professor and Chair at Northwestern University.
D-Luciferin, Potassium Salt | Gold Biotechonology | LUCK-100 | Store away from light |
Living Image Software | Caliper Life Sciences | Contact for Quote | none |
Xenogen Lumina | Caliper Life Sciences | Contact for Quote | none |
24-well; Standard tissue culture; flat-bottom | Falcon | 353047 | |
CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay | Promega | G3582 | none |
Synergy 2 Multi-Mode Reader | BioTek | Contact for Quote | none |
96 well Assay Plate, Black Plate, Clear bottom with Lid, Tissue culture Tretaed | Coster | 3603 | none |
Ketaset | Pfizer | NDC 0856-2013-01 | Control substance |
Xylazine | Sigma-Aldrich | 23076-35-9 | none |
28G Needle (with syringe) | Fisher | 22-004-270 | AKA Insulin Syringe |
2% Chlorhexidine | Fisher | NC9756995 | AKA “Nolvasan” |
3% Hydrogen Peroxide | Fisher | H312P-4 | Store away from light |
Ophthalmic Ointment | Cardinal Health | 1272830 | AKA “Akwa Tears” |
25G 1 1/2 needle | BD Becton Dickinson | 305127 | none |
Disposable Scalpels | Feather | 2975 | No. 21 |
Gauze | Fisher | 22028563 | Autoclave before use |
Heating Pad | Dunlap | HP950 | none |
Skin Stapler, Staples, Remover | Stoelting | 59020 | none |
PDI Alchol Prep Pads | Fisher | 23-501-711 | none |
Reflex 7mm Wound Clips 100 pack | Brain Tree Scientific, INC | 203 1000 | Autoclave before use |
Reflex 7mm Wound Clip Applier | Brain Tree Scientific, INC | 204 1000 | Autoclave before use |
Reflex 7mm Wound Clip Remover | Brain Tree Scientific, INC | 205 1000 | none |
Single Ended Round Tip Swab with Wood handle | Qosmedix | 10107 | Autoclave before use |
Hanks' Balanced Salt Solution without Ca2+ and Mg2+ (HBSS) | Gibco | 14170-112 | none |
Hamilton Syringe | Hamilton | 80300 | none |
FuGENE 6 Transfection Reagent | Promega | E2961 | none |
Bone Wax | Harvard Apparatus | 599864 | none |