GL261 glioma cells provide a useful immunocompetent animal model of glioblastoma. The goals of this protocol are to demonstrate proper techniques for monitoring intracranial tumor growth using in vivo bioluminescence imaging, and to verify the utility of luciferase-modified GL261 cells for studying tumor immunology and immunotherapeutic approaches for treating glioblastoma.
In contrast to commonly reported human glioma xenograft animal models, GL261 murine glioma xenografts recapitulate nearly all relevant clinical and histopathologic features of the human disease. When GL261 cells are implanted intracranially in syngeneic C57BL/6 mice, the model has the added advantage of maintaining an intact immune microenvironment. Stable expression of luciferase in GL261 cells allows non-invasive cost effective bioluminescence monitoring of intracranial tumor growth. We have recently demonstrated that luciferase expression in GL261 cells does not affect the tumor growth properties, tumor cell immunomodulatory cytokine expression, infiltration of immune cells into the tumor, or overall survival of animals bearing the intracranial tumor. Therefore, it appears that the GL261 luciferase glioma model can be useful in the study of novel chemotherapeutic and immunotherapeutic modalities. Here we report the technique for generating stable luciferase expression in GL261 cells and how to study the in vitro and in vivo growth of the tumor cells by bioluminescence imaging.
Malignant glioma is the most common and most lethal human brain tumor. Even when treated with maximal surgical resection, radiotherapy, and chemotherapy, median survival remains 15-20 months at major brain tumor referral centers1, 2, 3. The most aggressive form of malignant glioma, glioblastoma, is characterized by mitotic figures, neovascularization, invasion into adjacent brain, and pseudopalisading necrosis. Orthotopic brain tumor xenografts using human brain tumor cells have served an essential function in neuro-oncology research and facilitated pre-clinical translation for testing of new agents, prior to entry into human clinical trials. Whereas most of human xenograft models recapitulate many features of the human disease, a fundamental limitation with all human-based xenograft model systems is the use of immunodeficient animals4.
The absence of an intact host response clearly modifies tumor growth both in terms of tumor morphology, and efficiency of engraftment. While certain assumptions are acceptable in the interpretation of results from xenografted models, achieving relevant conclusions in the area of therapeutic assessment is a challenge. Certain fundamental biologic features are likely to be similar in immunodeficient and immunocompetent animals, but others such as tumor associated inflammation, tissue invasion, response to injury are probably very different. In contrast, GL261 is a chemically induced murine glioma cell line that accurately recapitulates glioma when implanted into the brains of immunocompetent syngeneic C57BL/6 mice5. Similar to the human disease, intracranial tumor growth rapidly and reproducibly leads to neurologic symptoms and animal demise6-10.
Subcutaneous tumor growth can be directly measured. Intracranial tumor growth can only be measured with animal sacrifice or with costly imaging studies. Stable expression of the enzyme luciferase allows non-invasive and cost-effective intracranial bioluminescence imaging11. Bioluminescence of luciferase transfected GL261 cells correlates well with intracranial tumor growth. We have recently directly compared GL261 to luciferase modified GL261 cells and demonstrated no difference in in vitro growth and invasion, immunologic cytokine profile, in vivo survival of intracranial tumor bearing C57BL/6 mice, or immune cell infiltrate. This technique is applicable to glioblastoma preclinical studies which involve non-invasive monitoring of tumor growth.
GL261 muizen glioomcellen, wanneer intracraniaal geïmplanteerde syngene immuuncompetente in C57BL / 6-muizen, bieden een aantal voordelen in vergelijking met humane glioma xenograft diermodellen. Veel van xenogetransplanteerde tumoren groeien als ingekapselde letsels die niet nauwkeurig niet herhalen de invasieve ziekte bij de mens. Daarentegen GL261 tumor toont niet alleen invasie in aangrenzende hersenen, maar ook neovascularisatie, mitotische figuren en diepe necrose 7. Het belangrijkste is het bestuderen tumorimmunologie of immunotherapeutische strategieën 15, 16, de C57BL / 6 muis behoudt een intact immuunsysteem 8. Eerdere studies hebben aangetoond robuuste expressie van het immuunonderdrukkende cytokine TGF-β en intracraniale tumoren bevatten immunosuppressieve T-regulerende cellen vergelijkbaar met humane glioblastoma 9, 10.
De eenvoudige techniek beschreven maakt stabiele expressie van luciferase door GL261 cellen. We hebben onlangs gemeld Similar in vitro es in vivo groei van cellen GL261.luc opzichte GL261 cellen naast soortgelijke tumor histologische kenmerken en immuuncel 17 infiltreren. GL261.luc cellen stabiel tot expressie luciferase die de oxidatie van het substraat luciferine omzetten van chemische energie fotonen en dus detecteerbaar licht katalyseert. Luciferine kan veilig worden toegediend aan dieren en passeert de bloed-hersenbarrière na intraperitoneale of intraveneuze injectie. In kleine proefdieren, zoals muizen, kan de bioluminescentie extern worden gedetecteerd in een niet-invasieve manier 11. Daarom kan tumorgroei serieel worden geëvalueerd zonder dat dierenoffer of dure MRI of CT-beeldvorming.
De kritische stappen in het protocol omvatten, niet alleen de lentivirale transductie, maar ook de controle van de stabiele expressie van luciferase in vitro alvorens te beginnen met in vivo experimenten. Verlies van transductie kan buitere herhalen lentivirus infectie. Invoering van een antibioticum resistentiegen in de expressievector kan ook worden gebruikt om te selecteren op luciferase-expressie. Zorgvuldige techniek vereist intracraniale implantatie reproduceerbaar plaats een substantieel aantal cellen in een exacte anatomische locatie aan vergelijking van verschillende behandelingsgroepen toelaten. Een belangrijk verschil tussen de huidige studie en eerdere studies van luciferase expressie GL261 cellen is het gebruik van een vrije hand techniek voor het implanteren van cellen in vergelijking met het gebruik van een stereotactische kader 18. We hebben eerder aangetoond consistente implantatie resultaten met de vrije hand techniek 19. Het voordeel van de vrije hand techniek is het vermogen om hoge doorvoer analyse van verschillende behandelingsmiddelen voeren. In onze handen, kunnen we ongeveer 60 dieren geïmplanteerd in 1 uur.
Na het beheersen van de techniek, de toekomstige toepassingen van de techniek zijn eindeloos. Zoals GL261 demonstrates verhoogde mitose en snelle tumorgroei vergelijkbaar met humane glioblastoma, kunnen antiproliferatieve behandeling geëvalueerd. Evenzo kunnen anti-invasieve en anti-angiogene therapieën worden gebruikt als GL261 tumoren invasief en angiogene. Voorzichtigheid moet worden gebruikt bij het beoordelen van het effect van chemotherapeutische middelen die gericht zijn op de menselijke doelen. In vergelijking met eerdere studies gebruik te maken van de menselijke glioblastoma xenograften uiten luciferase 20, zou dit worden beschouwd als een beperking van ons model. Ook kan het effect van immunotherapeutische strategieën tumorgroei bestudeerd in de GL261 xenotransplantatie model.
The authors have nothing to disclose.
We would like to thank Rajwant Kaur for technical assistance. We would like to thank Maxwell Tom for assistance with lentivirus preparation. This work was supported by the Reza and Georgianna Khatib Endowed Chair in Skull Base Tumor Surgery at UCSF, and the Michael J. Marchese Professor and Chair at Northwestern University.
D-Luciferin, Potassium Salt | Gold Biotechonology | LUCK-100 | Store away from light |
Living Image Software | Caliper Life Sciences | Contact for Quote | none |
Xenogen Lumina | Caliper Life Sciences | Contact for Quote | none |
24-well; Standard tissue culture; flat-bottom | Falcon | 353047 | |
CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay | Promega | G3582 | none |
Synergy 2 Multi-Mode Reader | BioTek | Contact for Quote | none |
96 well Assay Plate, Black Plate, Clear bottom with Lid, Tissue culture Tretaed | Coster | 3603 | none |
Ketaset | Pfizer | NDC 0856-2013-01 | Control substance |
Xylazine | Sigma-Aldrich | 23076-35-9 | none |
28G Needle (with syringe) | Fisher | 22-004-270 | AKA Insulin Syringe |
2% Chlorhexidine | Fisher | NC9756995 | AKA “Nolvasan” |
3% Hydrogen Peroxide | Fisher | H312P-4 | Store away from light |
Ophthalmic Ointment | Cardinal Health | 1272830 | AKA “Akwa Tears” |
25G 1 1/2 needle | BD Becton Dickinson | 305127 | none |
Disposable Scalpels | Feather | 2975 | No. 21 |
Gauze | Fisher | 22028563 | Autoclave before use |
Heating Pad | Dunlap | HP950 | none |
Skin Stapler, Staples, Remover | Stoelting | 59020 | none |
PDI Alchol Prep Pads | Fisher | 23-501-711 | none |
Reflex 7mm Wound Clips 100 pack | Brain Tree Scientific, INC | 203 1000 | Autoclave before use |
Reflex 7mm Wound Clip Applier | Brain Tree Scientific, INC | 204 1000 | Autoclave before use |
Reflex 7mm Wound Clip Remover | Brain Tree Scientific, INC | 205 1000 | none |
Single Ended Round Tip Swab with Wood handle | Qosmedix | 10107 | Autoclave before use |
Hanks' Balanced Salt Solution without Ca2+ and Mg2+ (HBSS) | Gibco | 14170-112 | none |
Hamilton Syringe | Hamilton | 80300 | none |
FuGENE 6 Transfection Reagent | Promega | E2961 | none |
Bone Wax | Harvard Apparatus | 599864 | none |