Preparation of protein-functionalized planar glass-supported lipid bilayers, determination of protein mobility within and measurement of protein densities is shown here. A roadmap to building a noise-reduced Total Internal Reflection microscope is outlined, which allows visualizing single bilayer-resident fluorochromes with high spatiotemporal resolution.
In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background in optics and laser physics to a discipline that is now enjoying vivid attention by life-scientists of all venues 1. This is because single molecule imaging has the unique potential to reveal protein behavior in situ in living cells and uncover cellular organization with unprecedented resolution below the diffraction limit of visible light 2. Glass-supported planar lipid bilayers (SLBs) are a powerful tool to bring cells otherwise growing in suspension in close enough proximity to the glass slide so that they can be readily imaged in noise-reduced Total Internal Reflection illumination mode 3,4. They are very useful to study the protein dynamics in plasma membrane-associated events as diverse as cell-cell contact formation, endocytosis, exocytosis and immune recognition. Simple procedures are presented how to generate highly mobile protein-functionalized SLBs in a reproducible manner, how to determine protein mobility within and how to measure protein densities with the use of single molecule detection. It is shown how to construct a cost-efficient single molecule microscopy system with TIRF illumination capabilities and how to operate it in the experiment.
يمكن فهم الآليات التي بروتينات الغشاء الوفاء وظيفتها الخلوية غالبا ما تكون مهمة صعبة، لأنه غالبا ما يتم تعريف وسائط عملها عن طريق التفاعلات تقارب منخفضة، مما يصعب اكتشاف وتقييم منهجيات الكيميائية الحيوية التقليدية. بروتينات الغشاء قد علاوة على ذلك يتم التخصيب في مجالات محددة غشاء 5،6 أو تشكيل هياكل النظام أعلى ديناميكية، والتي يمكن من حيث المبدأ تغيير نشاطها البيولوجي 7.
وبالتالي غير الغازية بمساعدة الليزر مضان جزيء واحد المجهر أصبحت منهجية اختيار لدراسة السلوك البروتين في البيئات الخلوية المعقدة. هذا هو على وجه الخصوص ينطبق على العمليات الكيميائية الحيوية التي تحدث في الغشاء البلازمي، وهذه يمكن من حيث المبدأ يمكن رصدها في خفض الضوضاء التأمل الداخلي الكلي (TIRF) واسطة. هنا عينة الإضاءة تقتصر على ما يصل إلى 200 نانومتر شريحة رقيقة على مقربة من كوب سوrface، مما يؤدي إلى خسارة كبيرة في الخلفية الخلوية، ونظرا لخصائص ضوء الإثارة زائل، وأيضا في زيادة كبيرة في مضان كثافة إشارة 8،9. كلا جوانب مهمة عندما تهدف لقرار الموضعية والزمانية عالية في الكشف عن جزيء واحد.
مستو SLBs لا تتوافق فقط مع TIRF المجهري. عندما functionalized مع يغاندس المناسبة كما أنها توفر إمكانية الوصول المباشر إلى دراسة ديناميات الجزيئية الاعتراف خلية خلية لأنها تحدث في الخلايا المناعية أو الخلايا الأخرى. أنها يمكن أيضا أن تستخدم ببساطة لوضع خلايا متحركة وغير ذلك غير ملتصقة قريبة بما فيه الكفاية لشريحة زجاجية بحيث يمكن لهذه الخلايا يمكن تصويرها في TIRF الإضاءة، وهو مرغوب فيه للغاية عندما التجارب التوصيل التي تنطوي على تتبع جزيء واحد أو واحدة superresolution القائم على الجزيء. تحقيقا لهذه الغاية البروتينات لا بد من تحميلها على SLB كثيري التنقل. ميزة متأصلة من لى المستخدمة PIDS هي أنه لا يوجد ربط غير محددة من البروتينات على الإطلاق. وعلاوة على ذلك، يمكن اعتبار SLBs كما السوائل ثنائية الأبعاد مع القدرة الكامنة للشفاء أنفسهم. يتم تعويض المخالفات داخل الزجاج دعم ما يصل إلى درجة معينة. ويرد بروتوكول خطوة خطوة لتوليد طبقات ثنائية كثيري التنقل المكلفة البروتينات المثيرة للاهتمام. يوصف تشكيل SLBs مستو، والتي تحتوي على 1-بالميتويل-2-oleoyl-SN-glycero-3-phosphocholine (POPC) باعتبارها العنصر الرئيسي (90-99٪) والاصطناعية وfunctionalized الدهون 1،2-dioleoyl- SN -glycero-3 – {[N (5-الأمينية-1-carboxypentyl) iminodiacetic حمض] succinyl} النيكل الملح (DGS NTA، النيكل) في وفرة منخفضة (1-10٪). POPC يحمل واحدة الأحماض الدهنية المشبعة وغير المشبعة الأحادية واحد الأحماض الدهنية وتشكل طبقات ثنائية الدهون من سيولة عالية حتى في RT. DGS NTA ني يربط مع headgroup لذيول بولي الحامض الاميني وبمثابة مرساة للبروتينات الموسومة بولي الحامض الاميني لاختيار (الشكل 1).
"> الأهم من ذلك، يجب أن يتضمن الأجهزة المجهري عدد من الأجهزة الطرفية التي تم وصفها أدناه. مع المعلومات المقدمة وبعض المعارف الأساسية في مجال البصريات وفيزياء الليزر، ينبغي أن يكون أي الأحياء قادرة على بناء واحد الإعداد والتصوير الجزيء. وينبغي أن تكون عينة الإثارة مثالي تجرى على مجهر مقلوب في الانعكاس الداخلي الكلي (TIRF) واسطة لأن هذا النظام يقلل ضوء زائفة والخلفية المفرطة مما أدى خلاف ذلك من الخلوية لصناعة السيارات في مضان 9. لهذا، هدف-TIRF قادرة خاص (انظر أدناه)، وهناك حاجة إلى إضاءة ليزر. وبعض التجارب تتطلب مرات الإضاءة في نطاق ميلي ثانية واحدة وتعمل في تعاقب سريع. لتوفير الوقت إضاءة أو لتجنب التبييض غير المبررة التي تسببها الإضاءة المتكررة فإنه من المفيد في كثير من الأحيان لتقسيم الضوء المنبعث إلى اثنين أو أكثر من القنوات الطيفية. وهذا يسمح للقراءات في وقت واحد اثنين أو أكثر من ملفات تعريف الانبعاثات، والتي يمكن أن تصبح عاملا هاما عندما conducتجارب تينغ تنطوي على نقل فورستر الرنين الطاقة (الحنق). هنا الانبعاثات الناجمة عن واحد ضوء الإثارة النبض يمكن تسجيلها كلا من المانحين الحنق والحنق متقبل (كما الانبعاثات توعية). ينبغي للكاميرا التقاط ما يكفي من الفوتونات مع خلفية منخفضة بما فيه الكفاية لتصور fluorophores واحدة خلال فترة الإضاءة. برامج الكمبيوتر لابد وأن يكون على مستوى هذه المهمة لمزامنة اغلاق الإثارة والحصول على الصور. ويرد أدناه وفي الشكل 2 لمحة شاملة:الهدف-TIRF قادر: لالقائم على الهدف TIRF الإضاءة يجب أن تكون الفتحة العددية (NA) هدف مساوية أو أكبر من 1.4 باستخدام الشرائح الزجاجية القياسية (ن = 1.515) 9. التكبير يمكن أن تتراوح بين 60X إلى 150X. هدف ينبغي تصحيحه لونيا للسماح confocality عند التصوير fluorophores مختلفة.
الليزر: عدد عالج بالليزر متاحزادت الخيارات ص بشكل كبير خلال السنوات الماضية. ليزر ديود موجة مستمرة modulatable إلكترونيا الحديثة ذات الكفاءة من حيث التكلفة ويمكن تشغيلها مع تواتر لم يسبق له مثيل والسرعة. أغلى ليزر ايون الغاز التفوق في الجودة شعاع الليزر، ولكنها تتطلب اغلاق خارجي (انظر أدناه)، وغالبا ما اسعة (الإمداد) التبريد.
مصاريع الإثارة: جهري صوتية البصرية (AOM) تسمح اغلاق سريع في تعاقب سريع 10. لاغلاق محكم على مزيج من AOM مع مصاريع الميكانيكية ويوصى. يتم تجنب هذا الطريق التدفئة واسعة من AOM بسبب التعرض للضوء مستمر ويتم إلغاء ضوء يتسرب من AOM في خارج موقف خارج.
وتستخدم العدسات لتوسيع أشعة الليزر، والتركيز لهم على طائرة الوصل الخلفي من الهدف. بهذه الطريقة، وعلى ضوء الإثارة يترك الهدف بمثابة شعاع مواز (الشكل 3)، وهو مطلوب لTIRF الإضاءة العينة. ونقل مركز التنسيق داخل طائرة الوصل الخلفي من مركز في محيط الهدف تغيير الزاوية التي شعاع يترك الهدف، ولكن ليس في موقع بقعة الليزر في العينة (الشكل 3)، والتي هي وظيفة للهندسة شعاع الشاملة. تستتبعه TIRF الإضاءة في زاوية حرجة، والتي يمكن تعديلها باستخدام مجموعة من المرايا يعمل بمثابة المنظار لترجمة النقطة المحورية ليزر داخل الطائرة المحورية لهذا الهدف. العدسات ينبغي تصحيحه لونيا، ويمكن استخدامها في مجموعة من اثنين أو ثلاثة العدسات. يتكون نظام الثلاث عدسة اثنين من العدسات بوصفها تلسكوب لتوسيع شعاع ليزر (وبالتالي بقعة الإضاءة في العينة) وعدسة ثالثة لتركيز شعاع موسع في طائرة الوصل الخلفي من الهدف (الشكل 4). يمكن أيضا أن يتحقق على حد سواء وظائف (التلسكوب والتركيز) من خلال مزيج من اثنين من العدسات فقط (انظر الشكل 4).
<p class="jove_content"> يجب أن تكون مرايا لا يقل عن 95٪ عاكس لتجنب فقدان ضوء الليزر. لكل تعديل شعاع يتم تطبيق مجموعة من اثنين من المرايا وعادة ما هذا الترتيب غير كافية لضبط بالضبط أي زاوية وموقف شعاع الليزر.تعكس تراكب مزدوج اللون وتنقل الضوء من موجات محددة مختلفة وتستخدم لركب أو تقسيم أشعة الليزر اثنين.
مرشحات Polychroic هي أكثر تعقيدا من مرشحات مزدوج اللون، وهناك حاجة لتعكس الضوء الإثارة واردة ونقل تخرج ضوء الانبعاثات من العينة. يتم وضعها في مكعب مرشح بين الهدف والعدسة أنبوب المجهر.
تنظيف الفلاتر: اعتمادا على نوع من صاحب العمل الليزر د الليزر تنظيف المرشحات مع عرض النطاق الترددي انتقال ضيق ينبغي أن توضع في شعاع الليزر مباشرة بعد خروجها من الليزر.
مرشحات الشقمصممة لاستيعاب نحو فعال ضوء الليزر مع عرض النطاق الترددي الضيق ونقل جميع الخفيفة الأخرى. يتم وضعها ضمن مسار الانبعاثات لتصفية أي زائفة ضوء الإثارة الليزر. لكن تحقيقها فلاتر تعمل فقط عند 0 درجة زاوية واردة. إذا كانت الفرقة العرض للمرشح الشق حاد جدا، قد لا تعكس زوايا مختلفة واردة أكثر من ذلك. لا يتأثر حجب ضوء الليزر ليزر موازى، ولكن الضوء المتناثرة العودة قد لا تكون أعاقت كفاءة من الوصول إلى الكاميرا.
تصفية العجلات المزودة بمحركات مزودة بمرشحات المناسبة عجلات يمكن وضعها بسهولة في الإثارة وانبعاث مسار وتسمح التحول بسيط بين شدة الضوء المختلفة (عندما تكون مجهزة بمرشحات ND) أو قنوات الفلورسنت (عند وضعها أمام زينون أو مصباح الزئبق قوس لratiometric التصوير الكالسيوم أو أمام الكاميرا لاختيار لfluorophore الباعث للضوء).
50:50 مكعب شعاع الخائن جويمكن استخدامها لتقسيم أشعة الليزر على مسارين منفصلين الإثارة شعاع وأيضا إلى الجمع بينهما أمام منظار.
شعاع الخائن (مسار الانبعاثات): لسرعة الحصول على الصور من دون أي حاجة لإجراء تغييرات تصفية الجسدية، يتم تقسيم شعاع الانبعاثات إلى قناة الأزرق تحول والحمراء تحول. من حيث المبدأ، شق شعاع يمكن أن يبنى من خلال توظيف إسفين مزدوج اللون أو مجموعة من المرايا ومرآة مزدوج اللون لفصل شعاع الانبعاثات بطريقة تعتمد على الطول الموجي. وهناك حاجة إلى المرشحات الانبعاثات اثنين لتنظيف قنوات المنبعثة.
مرشح المكاني: تصفية المكانية من شعاع الإثارة مطلوب أحيانا لإزالة أشعة الضوء غير متوازية المنبعثة من أشعة الليزر ذات جودة منخفضة. يتكون مرشح المكاني للتلسكوب يومين مع عدسة ذات الثقب صغير يوضع بالضبط في نقطة محورية في كل من العدسات. هذا الضوء زائفة طريقة الناتجة عن الأجزاء غير متوازية من شعاع الليزر يصبح سدت بكفاءة. سويجب أن تتحقق الشروط CH عند وضع المجهر على أساس TIRF. زيادات تصفية المكانية مع الثقوب الصغيرة، التي هي أكثر صعوبة لوضع في نقطة محورية، ومع أطوال أصغر من العدسة الأولى. للحد من الآثار الناجمة عن الانحرافات عدسة فإنه من المفيد أن توظف بدلا من العدسات بسيطة ذات جودة عالية وأهداف المجهر لتصحيح ما لا نهاية مع التكبير المنخفض (10X 20X أو).
الناظور: A الإعداد منظار ضروري لترجمة تركيز شعاع الليزر داخل طائرة الوصل الخلفي من الهدف، وهو شرط أساسي لTIRF التصوير. ويمكن أن يبنى بسهولة من اثنين من المرايا اثنين بوصة، وهي مرحلة متعدية لضبط المرآة الأولى وآخر لتحديد المواقع مرآة الثانية لتعكس اتسعت وركزت الإثارة شعاع إلى المجهر (الشكل 5).
وتستخدم مضيئة العودة الإلكترو بضرب الأجهزة المسؤول يقترن (EMCCD) بشكل روتيني ل: الكاميراتسجيل إشارات جزيء واحد. وذلك لأن من كفاءة الكم العالية (تصل إلى 95٪)، وارتفاع سرعة اكتساب (تصل إلى 30 ميغاهيرتز)، وانخفاض مستوى الضجيج نسبيا. تهدئة ل-80 ° C يقلل من الضوضاء الحرارية ويدعمه عدد من المتاحة حاليا الكاميرات EMCCD. وجود قيود على تكنولوجيا EMCCD هو أن الضوضاء كاميرا يزيد خطيا مع كل من كسب الكاميرا وإشارة يتم القبض. ليست هذه هي الحال مع العلمية CMOS (sCMOS) الكاميرات، والتي هي أقل تكلفة وتشغيل نظرا لبنية خاصة من الشريحة sCMOS أيضا أسرع بكثير من الكاميرات EMCCD. لكن مشكلة المرتبطة تكنولوجيا CMOS هي أن الحصول على الصور لا تزال تفتقر إلى حد ما من قراءات الكمية على مستوى جزيء واحد، لأن كل بكسل ملامح حساسية الكشف مختلفة. من حيث المبدأ هذا يمكن تعويضه من خلال بكسل التطبيع، ولكن هذا الإجراء هو بأي حال من الأحوال تافهة 11. هذا هو السبب في أننا لا تزال تتردد في إعادةنشيد كاميرات sCMOS للفحص المجهري جزيء واحد، ولكن بالنظر إلى التطور السريع لهذه التكنولوجيا، قد أصبحت الكاميرات sCMOS قريبا الكاميرا في الاختيار. بطيئة كاميرات CCD مسح الكاميرات تجنب المتعلقة التضخيم الضوضاء وبكسل الفرق كل ذلك معا وتدعم أسرع معدلات اقتناء ما اذا كان يمكن أن تعمل في ما يسمى وضع "الحركية". في هذا الوضع رقاقة الكاميرا بأكمله ما عدا المنطقة ذات الاهتمام (ROI) هو ملثمين، مما يجعل من الممكن استخدام الرقاقة نفسها كجهاز تخزين. بعد تعرض ROI لأول مرة، وتحولت التهم مما أدى إلى منطقة ملثمين من خط رقاقة بكسل خط بكسل، حيث محمي الصورة من مزيد من التعرض للضوء. وبمجرد الانتهاء من تحويل جميع خطوط ROI في المنطقة ملثمين (في المدى ميلي ثانية واحدة دون)، والعائد على الاستثمار في حد ذاته هو على استعداد للتعرض المقبل. وتتكرر هذه الدورة حتى يتم تحميل جميع خطوط بكسل للرقاقة CCD. رقاقة وثم قرأ ببطء مع ملحوظ reduالضوضاء قراءات دائرة الهندسة المدنية. على سبيل المثال على رقاقة بكسل 1000 x 1300، 20 رويس من 50X50 بكسل يمكن تسجيلها في تعاقب سريع. لأن الصور لا تزال على الرقاقة لفترة طويلة قبل أن تلا، فمن الأهمية بمكان لضمان الجودة العالية واخفاء لتبريد الكاميرا (على سبيل المثال مع النيتروجين السائل) كوسيلة للحد من الضوضاء الحرارية المفرطة. بعض الكاميرات EMCCD أيضا دعم الوضع الحركي.
البرنامج: توقيت الليزر، المصاريع، AOMS والتعرض الكاميرا، فضلا عن تخزين الصور السليم جزء لا يتجزأ من أي تجربة التصوير ناجحة. من حيث المبدأ يمكن برمجتها العديد من العمليات المحددة مع حزم البرامج المتاحة التي تأتي مع الكاميرا. حزم البرمجيات التجارية دعم عدد كبير من الأجهزة الطرفية، والتي يمكن تنفيذها مع القليل المعرفة التقنية.
مولد النبض، والحصول على البيانات (دق) مجلس (مع التناظرية والرقمية قنوات الانتاج) والذبذبات: مولد النبض هواختيار ممتاز لتحويل النبضات الزناد في نبضات زمنية محددة والجهد. بهذه الطريقة ليزر يمكن التحكم بدقة لانتاج الطاقة وانتهت في ميلي ثانية واحدة إلى مجموعة ميلي ثانية واحدة الفرعية. مجالس دق مع مخرجات التناظرية تحقيق نفس ودمجها بسهولة في اللوحة الأم للكمبيوتر عبر فتحات PCI. يتم التحقق من مدة النبضة، والسعة والتردد مع الذبذبات.
الضميمة من كامل مسار الإثارة شعاع: لتجنب التقلبات في ملف تعريف الإثارة بسبب convections الهواء وينبغي إغلاق كامل مسار شعاع الإثارة من بيئة معملية لها. هذا الإجراء أهمية خاصة عند إجراء TIRF المجهري. محمية المكونات البصرية أيضا من الغبار والعين البشرية من التعرض للضوء ليزر. يمكن أن يكون بناء اسوار بسهولة من الأسود متن بطاقة، التي يمكن شراؤها في المتاجر فنون العرض.
لتحديد سيولة استرداد SLB الإسفار بعد Photobleacهينج (FRAP) القياسات 12 يتم تنفيذها. لFRAP وجود مسارين الإثارة شعاع من المستحسن (انظر الشكل 3). تم تصميم مسار الشعاع الأول لصورة مضان من طبقة ثنائية. ويمكن القيام بذلك في تكوين TIRF ومع شدة الإضاءة الخافتة. يجب أن يسمح مسار الشعاع الثاني لمسافة قصيرة ولكن مكثفة نبض التبييض ويجب أن يتم تكوين في غير TIRF الوضع، بحيث يترك الهدف على طول المحور البصري. يمكن وضع فتحة مستديرة في مسار شعاع الإثارة (انظر الشكل 8) لمشروع لمحة التبييض مستديرة تماما مع حواف محددة. من أجل صورة هذا الفتحة على الطائرة الكائن، موقفها الأمثل سيكون في المستوى البؤري للعدسة 3 (انظر الشكل 3). ولكن نظرا لطول بؤري طويل من هذه العدسة، كما يمكن إنشاء صورة الفتحة ذات جودة كافية، عندما يتم وضع فتحة في المواقف تحولت قليلا.
بعد أن تي يؤديهاكان التصوير التجربة يجب تحليل البيانات الخام بشكل مناسب. وتقدم عدة بروتوكولات خطوة بخطوة، والتي تغطي تعديل الإعدادات الرئيسية (مثل قوة الإضاءة والوقت، TIRF زاوية)، والحصول على البيانات وتحليلها.
يوفر المجهر جزيء واحد فرصة فريدة لدراسة سلوك البروتينات داخل البيئة الخلوية طنهم. يصبح التصوير الجزيئي وبالتالي جذابة على نحو متزايد إلى مجتمع علمي واسع النطاق، ولكن العديد من العلماء الحياة خجولة لا يزال بعيدا عن الاستثمار الأولي في التكنولوجيا والخبرة. الفائدة الرئيسية الناجمة عن تجميع نظام واحد التصوير الخاص هو أنه يمكن تعديلها بسهولة لحاجة معينة أي شخص.
كما اقترح هنا على غير TIRF الإثارة شعاع يمكن تنفيذها بسهولة بالإضافة إلى مسار الضوء TIRF القائمة، إذا كان المطلوب الصور وتبييض السريع ومحددة (أو -activation) من fluorophores وبروابط، على سبيل المثال عند تنفيذ FRAP أو يجند التجارب uncaging 14 . إدخال الخائن شعاع الانبعاثات يسمح للتسجيل في وقت واحد من اثنين على الأقل وفي بعض الحالات تصل إلى أربع قنوات الفلورسنت. قائمة ملحقات هي في جوهرها محدودة فقطخيال المرء.
على سبيل المثال، تنفيذ الآلية عجلة تصفية الانبعاثات في مسار الانبعاثات يسمح التبديل السريع بين ما يصل إلى عشر قنوات الفلورسنت مختلفة. عند الجمع بين اثنين من العجلات المزودة بمحركات مرشح الانبعاثات (كل منها مزودة فتحات 10 فلتر) في سلسلة، وتصل إلى 18 قنوات الفلورسنت يمكن أن تقرأ. ويمكن استكمال التصوير القائم على TIRF مع القياسات تعبئة الكالسيوم والتدخل انعكاس المجهري (IRM) بعد دمج مسار مصباح زينون الإثارة أو الزئبق. IRM هو الأسلوب المفضل لتصور مدى تعلق خلايا على سطح الزجاج أو SLB، ويمكن بالتالي توفير المعلومات الهامة عند تفسير البيانات التصوير القائم على TIRF. إنشاء الإثارة شعاع موسع مع استخدام مرآة مزدوج اللون بسيطة والليزر إضافي من 405 نانومتر يسمح إجراء الفحص المجهري تنشيط ضوئي توطين (PALM) أو العشوائية المجهر إعادة البناء الضوئي (STORM)، أي اثنين superresolutمنهجيات أيون مع دقة الموضعية أقل من الحد حيود الضوء المرئي 15،16.
ومع ذلك، نجاح التجربة ليست سوى مسألة الأجهزة المناسبة. للاستفادة الكاملة من التصوير القائم على TIRF-انخفاض الضوضاء، وينبغي أن خلايا اجراء اتصالات على سطح بطريقة لا تفرض قيودا على سطح الخلية أو أن يتدخل في علم وظائف الأعضاء من غشاء البلازما الخاصة بهم. SLBs functionalized مع البروتينات مناسبة لالتصاق الخلايا وتزيد مناسب تماما لهذا الغرض لأن كل بروابط SLB جزءا لا يتجزأ من متحركة أفقيا وضبط الموقف الجانبي في غضون طبقة ثنائية ردا على مستقبلات ديناميات ملزمة والعزل.
لتصنيع SLBs بطريقة قابلة للتكرار، فمن الأفضل أن تبدأ مع سيارات الدفع الرباعي عالية النقاء. كما هو موضح هنا، بالتالي فمن الأهمية بمكان إزالة الحويصلات عديد الصفاحات، التي يتم إنتاجها أيضا خلال صوتنة، في خطوتين تنبيذ فائق وهذه طnterfere مع تشكيل SLBs متجاورة يضم سيولة عالية. SLBs الشكل ذات جودة عالية فقط على أسطح زجاجية نظيفة. مرة واحدة وينبغي أن تستخدم الشرائح الزجاجية تنظيفها مباشرة أو تخزينها في فراغ. الأهم من ذلك، لا يجب أبدا أن يتعرض SLBs في الهواء لأن هذا من شأنه أن يؤدي إلى تعطل بهم. SLB غسل ينطوي، كما هو مبين، عازلة الشطف باستخدام ماصة المصلية، وهذه ليست فقط ولكن الإجراء أيضا لتوفير الوقت حفظ.
أثناء الحصاد وتنقية البروتينات SLB المقيمة ينبغي تجنب استخدام المنظفات. وذلك لأن المنظفات سيقلل التنقل البروتين بشكل كبير حتى عندما تكون موجودة بكميات ضئيلة. للتحايل على الحاجة إلى المنظفات كل ذلك معا، ويوصى التعبير للذوبان من polyhistidine يفرز مجهزة العلامة بروابط في خلايا الثدييات أو الحشرات. إذا refolding من الهيئات إدراج القولونية هو مطلوب، يجب أن تطبق بحذر لإزالة المنظفات بشكل فعال من الهيئات إدراج، قبل أن يقدموا غير الممثلة وrefolding.
والميزة الرئيسية لتوظيف نتائج SLBs من طبيعتها وحدات وreconstitutive، والذي يسمح لتشريح تحديدا دور مستقبلات يجند التفاعل نظرا لتنشيط الخلايا والتصاق الخلايا. في هذا الصدد من المهم أن نذكر أن أسهم دبي للذهب NTA ني ينبغي أن يكون حاضرا في 10٪ خلال SLB من أجل منع البروتينات التي تتنافس على مواقع الربط NTA-NI. عندما توظف SLBs إيواء سوى 1٪ أو 2٪ DGS NTA ني، والحد من اقتران أنواع البروتين الموسومة polyhistidine معين يمكن أن يكون لاحظت، وخصوصا عندما شارك في احتضان كميات متزايدة من أنواع البروتين polyhistidine الموسومة الثانية (غير منشورة الملاحظة). لا يلاحظ هذه الظاهرة عند العمل مع SLBs يضم 10٪ DGS NTA ني.
في حين لاحظنا أبدا غير محددة وملزمة من أي البروتين polyhistidine الموسومة اختبار لSLBs تحتوي على DGS NTA ني، ينبغي اختبار هذا الاحتمال عند تقديم البروتين لأول مرة،تحقيقا لهذه الغاية فإننا ننصح استخدام SLBs تخلو من DGS NTA ني (يجب أن البروتين لا يلزم). ثانيا، عند استخدام SLB تحتوي على DGS NTA ني، ينبغي أن البروتين تؤتي ثمارها تماما بعد غسل SLB مع برنامج تلفزيوني يحتوي على 300 ملي إميدازول.
ميزة هامة أخرى من توظيف SLBs هي أن التفاعلات عابرة ويشير أحداث يمكن رصدها مع تعزيز قرار الزمانية المكانية 17-19. هذا هو على الأقل جزئيا لأن يتم تقليل عملية ملزمة ثلاثية الأبعاد أساسا على بعدين التصوير، وخاصة عند التسجيل في طريقة TIRF الضوضاء المخفف. استخدام SLBs متوافق مع الكشف عن إشارة جزيء واحد، وهو شرط أساسي لتنشيط الصورة توطين المجهري (PALM) أو العشوائية المجهر إعادة البناء الضوئي (STORM)، أي superresolution المجهري مع قرار أقل من الحد حيود 15،16. هذه الطرائق التصوير الخاصة تمكن جزيء واحد فورستر الرنين الطاقة تراتجارب nsfer مصممة لتصور الفردية تفاعلات البروتين البروتين في بيئة متشابك 20. ويفسر هذا النهج بقدر كبير من التفصيل في منشور إن الرب يطلق عليه "قياس TCR-PMHC ملزمة باستخدام القائم على الحنق المجهر فحص" 21.
عند تفسير تجاربه التي تستند SLB-ينبغي للمرء أن نضع في اعتبارنا دائما أن هي واردة ليس كل خصائص الغشاء البلازمي للخلية حية من قبل SLBs، وأن بعض الصفات في عداد المفقودين قد تؤثر فسيولوجيا قيد التحقيق. بعد كل شيء، والبروتينات SLB جزءا لا يتجزأ من ونشرها بحرية وغير المنتظمة في microdomains غشاء لأن معظم نظرائهم الخلوية هي 5،6،22. أوراق غشاء البلازما يجمد المستمدة من الخلايا الملتصقة، الذي الحفاظ على بنية الغشاء البلازمي للخلايا الحية إلى حد ما، وقد استخدمت بنجاح لدراسة امتصاص من المستضدات جزءا لا يتجزأ من الغشاء بواسطة الخلايا الليمفاوية B-23. ولكن، حتى هذاالأغشية لا تتفاعل مع الهيكل الخلوي ديناميكية للغاية وتحتوي على أي مرونة كما يتم دعمها من سطح الزجاج جامدة. في ضوء هذه التناقضات ومن الواضح أن هناك حاجة لSLBs الهندسية، والتي توفر وسيلة لتجزئة البروتينات بطريقة محددة والتي تدعمها السطوح من المرونة للتعديل أو الأسطح التي تغير صلابتهم في الاستجابة لنبضات الضوء تطبيقها محليا.
The authors have nothing to disclose.
وأيد MA كتبها زمالة شرودنغر للصندوق النمساوية العلوم (FWF، J3086-B11)، وذلك بفضل ماكس-بلانك جمعية الدعم المالي والإداري. وأيد GS من صندوق العلوم والتكنولوجيا فيينا (WWTF، LS13-030). وأيد JH من صندوق العلوم والتكنولوجيا فيينا (WWTF، LS14-031).
#1.5 glass slides | VWR | 631-0853 | |
250ml round bottom flask | VWR | 201-1357 | |
50:50 beam splitter cubes | Thorlabs | BS013 | |
Acousto-opitcal modulator C1205-2 | Isomet | – | only necessary if CW lasers, which cannot be modulated, are used |
Alexa Fluor 488-NHS | Life technologies | A-20000 | |
Alexa Fluor 555-NHS | Life technologies | A-20009 | |
Alexa Fluor 647-NHS | Life technologies | A-20006 | |
autoclave tape | VWR | 489-1312 | or any other heat-stable sticky tabe |
Avanti Mini-Extruder | Avanti Lipids | 610000 | alternative to the bath sonicator |
bath sonicator QSONICA Q700 | QSONICA | Q700 | |
beam splitter | Cairn | P280/210/MLS | |
Büchi rotary evaporator | VWR | 531-0837 | |
camera | Andor | iXon Ultra 897 | see manuscript text for alternatives |
concentarted hydrogenperoxide | Roth | 9683.1 | |
concentrated sulfuric acid | Roth | X944.2 | |
epoxy glue | Uhu | 45705 | Uhu plus sofortfest 2min |
filter wheel | Sutter instruments | Lambda 10-2 | |
LabTek chambers | VWR | 734-2062 | |
laser | Toptica | – | different variants (wavelengths 375 – 785 nm) are available |
lens | Thorlabs, Newport | – | |
DGS NTA-Ni (lipid) | Avanti Lipids | 790404C | already in Choroform-solved delivered version of the nicekl salt variant is recommended |
POPC (lipid) | Avanti Lipids | 850457C | already in Choroform-solved delivered version is recommended |
microscope Zeiss Axiovert 200 | Zeiss | – | |
mirrors | Thorlabs | BB1-E02 | |
optical filters | AHF, Chroma, Semrock | – | filter sets are available for many different combinations of dyes |
oscilloscope | BK Precision | 2120C | |
phosphate buffered saline (PBS) | Life technologies | 14190-136 | degas before usage |
periscope | Thorlabs | RS99/M | |
picodent twinsil 22 | Picodent | 13001000 | alternative to the epoxy glue |
power meter Lasermate-Q | Coherent | – | any powermeter sensitive in the used spectral range will do |
pulse generator | Stanford Research Systems | SRS DG535 | |
spatial filter | Thorlabs | KT310/M | |
syringe filter 0.2µm | Millipore | GVWP04700 | |
TIRF-capable apochromat objective 100x, NA 1.46 | Zeiss | 440782-9800-000 | |
trichloromethane/chloroform | Roth | 3313.1 | |
tubes forultracentrifugation polycarbonate 1.00 mm, 11 mm x 32 mm | Thermo Fisher | 45237 | |
Sorvall ultracentrifuge | Thermo Fisher | RC M150GX | |
ultracentrifuge rotor | Thermo Fisher | S120-AT2 | |
UV spectrophotometer Nanodrop 2000c | Thermo Fisher | – | |
vacuum pump | VWR | 181-0248 |