Biz üç boyutlu yeniden insan kornea gibi epitel (RHCE) doku modelini kullanan bir göz tahrişi testi geliştirdi. Test göz irritan ve korozif malzemeler (GHS kategorileri 1 ve kombine 2) ve etiketleme (GHS yok Kategori) gerekmez olanlar arasında ayrım yapabiliyor.
AB Kozmetik Direktifi ve AB REACH mevzuatına Yedinci Değişiklik uymak için, insanda göz toksisite güvenilir ve doğru değerlendirilmesi için geçerli olmayan hayvan alternatif yöntemlere ihtiyaç vardır. Bu ihtiyacı karşılamak için, biz bir göz tahrişi testi normal insan hücrelerine dayanan üç boyutlu yeniden insan kornea gibi epitel (RHCE) doku modelini kullanır (EIT) geliştirdik. EIT göz tahriş edici ve korozif (GHS Kategori 1 ve 2 kombine) ve etiketleme (GHS yok Kategori) gerekmez o ayrı yapabiliyor. Test, iki ayrı protokolleri, sıvı kimyasal ve katı deney ürünleri için, bir ikinci benzer protokol için tasarlanmış bir kullanır. EIT tahmin modeli, tek bir maruziyet süresi (sıvılar için 30 dakika, katı maddeler için 6 saat) ve tek bir doku canlılığı kesme (MTT testi ile tespit edildiği üzere% 60.0) kullanır. EIT 95.5 / 68.2 / ve% 81.8 sens elde (44 sıvılar ve 39 katı) 83 kimyasallar için sonuçlara dayanarakiTivity / özgüllük ve doğruluk (SS & A) sıvılar için, katılar için / 68.4 100.0 / ve% 84.6, SS & A, ve 97.6 / 68.3 / ve genel SS & A için% 83.1. EIT düzenleyici test gereksinimlerini karşılamak için hayvanların kullanmadan sıvı ve katı kimyasalların geniş bir yelpazede göz irritasyon potansiyelini sınıflandırmak önemli katkıda bulunacaktır. EpiOcular EIT yöntemi TG 492 olarak OECD Test Rehberi içine 2015 yılında hayata geçirildi.
Bu tür kozmetik, deterjan ve ev temizlik gibi tüketici ürünleri onlar gözlerle temas halinde ciddi hasar neden olabilir kimyasalların çeşitli içerir. Bu nedenle, göz tahrişi için bu ajanların test tüketici güvenliğini 1 sağlamak için ABD ve AB düzenleyici kurumlar tarafından talep edilir. Karışımlar ve formülasyonlar göz tahrişi potansiyelinin değerlendirilmesi, aynı zamanda kimyasalların taşınması için AB Kozmetik Direktifi altında kozmetik maddelerin etiketlenmesi için REACH (Kayıt, Değerlendirme, Yetkilendirme ve Kimyasalların Kısıtlanması) ile mevzuat uyum için bir gereklilik olduğunu ve için pestisit ve ev ürünleri 2 etiketlenmesi. Şu anda, düzenleyici kurumlar Kimyasalların Sınıflandırılması ve Etiketlenmesi (GHS) 3 Küresel Uyumlaştırılmış Sistemi kullanılarak göz tehlike değerlendirmesini gerektirir. GHS ağırlıklı Draize göz tahrişi testinde dayalı, en yaygın olarak kullanılan göz tahrişi deneyi hangi yabancı maddeler ve mildemirbaşlar Tavşan gözünde 4 katılgan zar kesesi içine, doğrudan eklenir. GHS sınıflamasına göre, GHS Kategori 1 (göz aşındırıcılar) göz dokularında veya maruz kalma 3,5 izleyen 21 gün içinde tam olarak geri dönüşlü olmayan göz ve görme ciddi hasar şiddetli başlangıç yaralanmasına neden kimyasallar test eder. GHS Kategori 2 maruziyet 21 gün içinde tam olarak geri dönüşlü olan gözün önemli değişiklikler meydana kimyasallar test eder. Koroziflerin veya tahriş edici olmayan test kimyasalları GHS yok Kategori olarak adlandırılır.
40 yılı aşkın için, Draize tavşan gözü testi kendi tekrarlanabilirlik eksikliği, insani tepkilerin abartılması ve canlı hayvanların 5-8 kullanımı için eleştiriliyor. Bu kaygılar arıtma, indirgeme ve in vivo testte 9 değiştirilmesi için birçok önerilerde teşvik etmiştir. Valide hayvansal olmayan alternatifleri ihtiyacı daha da güçlendirildi(2009) Kozmetik (2005) kozmetik ürünlerinin güvenlik değerlendirmesinde hayvanların kullanılmasını yasakladı Direktifi ve malzemeyi Yedinci Değişiklik kabulü 2.
1996 yılından bu yana, yeniden kornea gibi doku modeli yaygın hammadde, yüzey aktif madde bazlı formülasyonların tahrişi potansiyelini değerlendirmek için, kozmetik endüstrisinde kullanılan ve kullanım için tasarlanmış karışımları birleşik veya gözün yakın olan 10-13. RHCE doku modelinin kullanılması doğal, sulandırılmamış formda doku yüzeyine test malzemesinin doğrudan topikal uygulama sağlar. Bu şekilde, suda çözünür olmayan formülasyonlar çözücüler ile inceltilmeden test edilebilir. Yaygın, uygulanabilir basit ve ekonomik yöntem için istek (Alternatif Yöntemler Doğrulama Avrupa Birliği Referans Laboratuarı Avrupa Merkezi) EURL ECVAM en cevaben Göz tahrişi Testi (EIT) bir singl kullanan hangie maruz kalma süresi ve etiketleme gerekmez malzemelerden göz tahriş edici ve korozif ayırmak mümkün (Şekil 1) 14 geliştirilmiştir. 83 kimyasalların (44 sıvılar ve 39 katı) için sonuçlara dayanarak, EIT 95.5 / 68.2 / ve% 81.8 duyarlılık / özgüllük ve doğruluk (SS & A) sıvılar için, katılar için 100.0 / 68.4 / ve% 84.6 SS & A ve 97,6 / elde 68.3 / ve genel SS & A için% 83.1.
2007 yılında, EURL ECVAM himayesinde Kozmetik Avrupa'da (eski Colipa) tarafından desteklenen bir multi-laboratuar öncesi doğrulama çalışması resmi doğrulama 15 o getirme hedefi ile EIT alaka ve güvenilirliğini değerlendirdi. Bu çalışmada, 298 bağımsız denemeler, yedi bağımsız laboratuvarda yapılmıştır. Çalışma sonuçları katılan tüm laboratuvarlar 15 arasında varyasyon düşük katsayılı tahmininde% 99.7 anlaşmasını gösterdi. Sonuç olarak, 2010 yılında EIT protokol resmi EURL ECVAM girdidoğrulama programı. Doğrulama çalışma, in vivo referans verileri (Draize tahrişi verileri) kullanılabilir hangi bireysel madde ve kimyasal karışımların da dahil olmak üzere 104 kodlu deney kimyasallar, kullandı. Bu çalışmanın başarısına dayanarak, OECD Taslak testi kılavuz It EIT UN GHS sınıflandırma ve etiketleme sistemine göre geniş bir malzeme yelpazesi göz irritasyon potansiyelinin sınıflandırılmasına önemli katkıda olacağı tahmin edilmektedir 2014 yılında sunuldu.
Biz EpiOcular doku modeli için geliştirilen Göz tahrişi Testi (Şekil 1) sunduk. GHS Kategori ayırt etmez, burada sunulan EIT duyarlılığı ve özgüllüğü 17. EIT yüksek derecesi ile etiketleme (GHS yok Kategori) gerekmez malzemelerden göz tahriş edici ve korozif (GHS Kategori 1 ve 2 kombine) ayırmak mümkün 1 Kategori 2 kimyasallar. EIT sınıflandırma ve kozmetik ve farmasötik maddeler dahil olmak üzere kimyasal, geniş bir oküler tahriş potansiyelinin etiketlenmesi için doğrulanmıştır. In vitro testlerde diğer ile birlikte, EIT in vivo tavşan göz tahrişi testi için bir yedek olarak hizmet verecek.
EIT maruz kalma ve maruz kalma sonrası kuluçka süresi (Şekil 1) uzunluğu değişir sıvı ve katı maddelerin, iki benzer ama farklı protokoller kullanmaktadır. EIT kullanılan son noktadaha önceden belirlenmiş bir insan epitel doku modellerinde 20,21 kullanılmıştır MTT testi ile tespit doku canlılığı vardır. Bu testte gerçekleştirmek için, standart hücre kültürü ekipmanları dışında hiçbir özel ekipman gerektirmez. Nedeniyle yüksek doku-doku tekrarlanabilirliği seviyesinde, n = 2 dokuların yerine, genellikle tavsiye n = 3 kullanılır. Yetenek n kullanmak = nedeniyle bireysel dokuların 14 farklı kullanım için, böylece ortaya çıkabilecek tahlil değişkenliği en aza deneyimli bir operatör aynı anda iki dokuları işlemek için izin verir çünkü 2 dokular, protokolün önemli bir yönüdür. Ayrıca, pozitif ve negatif kontroller ile birlikte, test maddesi başına n = 2 dokuları, aynı fiziksel durumuna (sıvı ya da katı madde), 10 test maddelerinin tahriş kullanarak, bir kit (24 dokular) kullanılarak değerlendirilebilir.
Malzemelerin güvenilir sınıflandırılmasını sağlamak Diğer önemli noktalar pozitif kontrol su için özellikleri vardırbstance (doku canlılığı ≤50.0%), yinelenen dokularda (fark <% 20.0) ve negatif kontrol OD okumaları (> 0,8 ile <2,5) arasındaki tekrarlanabilirlik.
EIT testi yaparken kuluçka dönemlerinde protokol veya değişikliklerden sapma değişmiş sonuca neden olabilir, çünkü o, valide protokol ve önerilen doz ve durulama programları (Tablo 3 ve 4) kalınması önemlidir. Aynı şekilde, MTT inkübasyon için 3 saat süre sapmalar farklı MTT okumalarına neden olur ve tahlil sonucunu etkileyebilir.
Bazen, bir test kimyasal MTT dokusu canlılığı deneyi veya MTT nedeni azaltılmasına engel olabilir, optik veya diğer özelliklere sahip olabilir. Örneğin, bir test bir kimyasal ile doğrudan mavi-mor reaksiyon ürünü olarak MTT azaltabilir veya MTT formazana (~ 570 nm) ile aynı aralıkta ışığı emen renkli bir madde olabilir. Ancak bu test kimyasalları pr olacakMTT tahlili esnasında, malzemenin yeterli miktarda de ince üzerinde mevcut olan (ya da tarafından emilen) ise, sadece bir sorun ESENT. Bu girişimi önlemek için, geniş durulama prosedürleri EIT protokole dahil edilmiştir. TA kaldırmaz durulama ve TA MTT azaltma karışıyorsa, ek kontroller tespit etmek için kullanılan ve bunun için doğru olmalıdır. Test kimyasal doğrudan MTT indirgemesi şüphesi varsa Kısaca, söz konusu kimyasal madde 50 ul (ya da katı maddeler için 50 mg), SCC (NC steril deiyonize su, 50 ul çalışma MTT çözeltisi ile 3 saat süre ile inkübe edilir, olmalıdır ) aynı anda çalışacak. MTT çözeltisi mavi-mor dönerse, test maddesi MTT azalttı tahmin edilmektedir. Bu durumda dondurularak öldürülmüş doku kontrolleri kullanarak işlevsel bir onay test malzemesi dokuya bağlanmasının ve bir sahte MTT indirgemesi bir sinyal verilmesine yol olup olmadığını değerlendirmek için gerçekleştirilmelidir. TA-maruz kalan, öldürülen doku kontrolünde kayda değer MTT azalma varsa(Tedavi edilmeyen canlı dokuda miktarına göre), test maddesi ortalama dokusu canlılığı öldürülmüş kontrolün ortalama canlılığını çıkarılarak düzeltilmelidir.
Yalancı negatif sınıflandırmalar 14,15,18 azlığı gösterdiği gibi EIT, güvenlik tarafında errs. Önemlisi, göze aşındırıcı ve GHS Kategori 1 kimyasallar, hiçbiri, en ciddi oküler tehlike temsil Bu deneyde 14,15,18,19 olarak tahriş edici olmayan olarak sınıflandırılmıştır. Son olarak, nitro test yönteminde RHCE önemli avantajlarından biri düzgün sıvı ve (iki boyutlu, su altı hücre kültürleri ile mümkün değildir) katı maddeleri test olasılığıdır.
EIT UN GHS sınıflandırma ve etiketleme sistemine göre geniş bir malzeme yelpazesi göz irritasyon potansiyelinin belirlenmesinde önemli ölçüde katkıda bulunacaktır. Hayvanların yerine o belirlenmesiküler toksisite yıllardır toksikolojik araştırma hedefi olmuştur. EIT test yöntemi 2014 yılında EURL ECVAM tarafından desteklenen bir resmi doğrulama çalışması yapmıştır ve EpiOcular EIT 2015 yılında OECD TG 492 olarak OECD test Rehberi içine uygulanmıştır.
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar EIT projeye adanmış yaptığı bilimsel destek ve zaman Dr John Harbell teşekkür etmek istiyorum. Yazarlar ayrıca, Beiersdorf AG şirketi (Almanya), IIVS (ABD), Mary Kay Inc (ABD), Avon Products Inc (ABD), Procter & Gamble / COSMITAL (İsviçre), Laboratoire Pierre Fabre (Fransa) teşekkür etmek istiyorum Harlan Laboratuvarları (United Kingdom), ve Göz tahrişi Testi 15 Multi-merkezi International Pre-Doğrulama ve doğrulama Çalışmaları katılım için LVMH Parfüm (Fransa).