Summary

同時<em> ex vivoで</emによる二つの網膜の>機能テスト<em> in vivoで</em>電図システム

Published: May 06, 2015
doi:

Summary

Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.

Abstract

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise from extra-retinal sources. Ex vivo ERG provides an efficient method to dissect the function of retinal cells directly from an intact isolated retina of animals or donor eyes. In addition, ex vivo ERG can be used to test the efficacy and safety of potential therapeutic agents on retina tissue from animals or humans. We show here how commercially available in vivo ERG systems can be used to conduct ex vivo ERG recordings from isolated mouse retinas. We combine the light stimulation, electronic and heating units of a standard in vivo system with custom-designed specimen holder, gravity-controlled perfusion system and electromagnetic noise shielding to record low-noise ex vivo ERG signals simultaneously from two retinas with the acquisition software included in commercial in vivo systems. Further, we demonstrate how to use this method in combination with pharmacological treatments that remove specific ERG components in order to dissect the function of certain retinal cell types.

Introduction

電図(ERG)は、光によって誘発網膜の電気的活動を記録するために使用することができ、十分に確立された技術です。 ERG信号は、網膜の抵抗性の細胞外空間に流れる(感光体と双極細胞の軸に沿って)半径方向の電流による電圧変化によって主に生成されます。最初のERG信号はフィッシュアイ1の表面からホルムグレンによって1865年に記録しました。アイントホーフェンとジョリー1908 2は、双極細胞ON、今主に光受容体の活性を反映することが知られている3つの異なるA-と呼ばれる波、B-、およびc波、への光の発症にERG応答を分割し、色素上皮細胞、それぞれ3-8。 ERGは、単離された眼用調製物9から、単離された無傷の網膜( エキソビボ )3,10-15間または微小電極を有する特定の網膜層にわたって、( インビボ )麻酔した動物またはヒトの目から記録することができます(ローカルERG)4,16。これらの中で、in vivoでの ERGは、現在、網膜機能を評価するために最も広く用いられている方法です。これは、診断目的のために使用することができ、あるいは、動物または患者における網膜疾患の進行を追跡するために非侵襲的な技術です。しかし、in vivoでの ERG記録は、多くの場合、外眼生理学的ノイズ( 例えば、呼吸や心臓活動)によって汚染された、いくつかの重複する構成要素との複雑な信号を生成します。

ローカルERGは網膜の特定の層を横切って信号を記録するために使用することができるが、それは、最も侵襲性であり、他のERG記録の構成と比較して最も低い信号対雑音比(SNR)を有しています。ローカルERGも技術的に厳しいですし、高価な機器( 例えば、顕微鏡とマイクロマニピュレータ)が必要です。無傷の、単離された網膜からTransretinal ERG(ex vivoでの ERG)は、インビボで安定した可能ローカルERG方法とHIGとの間の妥協を提供しています動物又はヒト17の無傷の網膜からのH SNRの録音。最近では、この方法は、哺乳動物、霊長類およびヒト網膜18-20に桿体および錐体光受容体の機能を研究するために首尾よく使用されています。また、原因エクスビボ網膜色素上皮が存在しないために、ERG信号の正のC波成分が除去され、顕著な負の遅いPIII成分は、ex vivoでの記録で明らかにされています。遅いPIII成分は網膜21-23におけるミュラーグリア細胞の活性に由来することが示されています。従って、 エキソビボ ERG方法も、無傷網膜におけるミュラー細胞を研究するために使用することができます。いくつかの研究はまた、 エクスビボで ERG記録が網膜24の周りの薬剤の濃度を測定し、薬物25-27の安全性及び有効性を試験するために使用され得ることを示しました。

複数の商業的なインビボ系が入手可能であり、必ずしも大規模な電気生理学的背景を持っていない多くの研究室で使用されます。これとは対照的に、ex vivoでのデバイスは、最近17まで利用されていないと、結果としてごく少数の研究室では、現在、この強力な技術を活用しています。これは、網膜の生理学および病理学についての知識を進めるために、および疾患を失明するための新しい治療法を開発するために、より多くの研究室へのex vivoでの ERG記録を利用できるようにすることが有益であろう。ここでは、単純で手頃な価格のエキソビボ ERG装置17を示し、それは棒状とコーン媒介シグナルを記録するために、いくつかの市販のin vivoでの ERGシステムと組み合わせて使用することができる方法を示す(A及びB波)と機能無傷の野生型マウスの網膜からミュラー細胞(PIIIを遅らせます)。

Protocol

全ての実験プロトコルは、実験動物の管理と使用に関する指針に従ったとワシントン大学の制度的動物研究委員会によって承認されました。 1.灌流および試料ホルダーの設定実験の日に新鮮な網膜灌流のための溶液を調製します。蒸留脱イオン水を使用してください。次の三つの溶液のいずれかを使用します。 重炭酸塩含有エイムズ」溶液(1 L)を:エイ?…

Representative Results

我々は、実験プロトコル上述の異なる標準灌流液( 図2)を用いて、 図1に示しに従って、暗順応の野生型(WT)C57BL / 6マウスの網膜からフラッシュ応答を記録しました。応答波形と速度だけでなく、桿体の感度はエイムスの類似しているように見えた」とロックのメディア( 図2AおよびB)。一方、HEPES緩衝リンガー液(重炭酸塩なしまたは5?…

Discussion

ここではex vivoで ERGアダプタと一緒にin vivoでの ERGシステムのコンポーネントを使用して、2つの単離されたマウス網膜から同時に高品質のex vivoでの ERG記録を得るための重要なステップを示しています。本研究では、同じ溶液(いずれかエイムズ'、ロックのあるいはリンゲル)と動物の両方からの網膜を灌流が、薬物検査のために別のソリューションの

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作品は、NIHの助成金のEY019312とEY021126(VJK)、ワシントン大学の眼科学部およびVisual科学へEY002687でサポートされていた、と研究によって失明を防ぐために。

Materials

In vivo ERG system OcuScience HMsERG www.ocuscience.us/id77.html
In vivo ERG system LKC Technologies UTAS-E 3000 www.lkc.com/products/UTAS/bigshot.html
Ex vivo adapter OcuScience Ex VIVO ERG adapter www.ocuscience.us/id107.html
Dissection microscope North Central Instruments Leica M80 May use any brand
IR emitter Opto Diode Corp. OD-50L www.optodiode.com
Prowler Night Vision Scopes B.E. Meyers Electro Optics D4300-I Military grade product.
Red filter Rosco Laboratories Roscolux #27 Medium Red May be used instead of IR system
Red head light OcuScience ERGX011 www.ocuscience.us/catalog/i29.html
Microscissors WPI, Inc. 500086 www.wpiinc.com/
Dumont tweezers #5 WPI, Inc. 14101
Razor blades Electron Microscopy Sciences 72000 www.emsdiasum.com
Scale Metler Toledo AB54-S/FACT May use any brand
pH meter and electrode Beckman Coulter pHI 350 May use any brand
NaCl Sigma-Aldrich S7653 May use any brand
KCl Sigma-Aldrich 60129 May use any brand
MgCl2 Sigma-Aldrich 63020 1.0 M solution
CaCl2 Sigma-Aldrich 21114 1.0 M solution
EDTA Sigma-Aldrich 431788 May use any brand
HEPES Sigma-Aldrich H3375 May use any brand
Sodium Bicarbonate Sigma-Aldrich S6297 May use any brand
Ames medium Sigma-Aldrich A1420 May use any brand
BaCl2 Sigma-Aldrich B0750 May use any brand
DL-AP4 Tocris Bioscience 101 May use any brand
Succinic acid disodium salt Sigma-Aldrich 224731 May use any brand
L-Glutamic acid Sigma-Aldrich G2834 May use any brand
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G7528 May use any brand
Leibovitz culture medium L-15 Sigma-Aldrich L4386 May use any brand
MEM vitamins Sigma-Aldrich M6895
MEM amino acids Sigma-Aldrich M5550
Carbogen Airgas UN3156 5% CO2

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Citar este artículo
Vinberg, F., Kefalov, V. Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System. J. Vis. Exp. (99), e52855, doi:10.3791/52855 (2015).

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