Samtidige<em> Ex vivo</em> Functional Test af to nethinder af<em> In vivo</em> Elektroretinogrammet System
Summary
Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.
Abstract
An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise from extra-retinal sources. Ex vivo ERG provides an efficient method to dissect the function of retinal cells directly from an intact isolated retina of animals or donor eyes. In addition, ex vivo ERG can be used to test the efficacy and safety of potential therapeutic agents on retina tissue from animals or humans. We show here how commercially available in vivo ERG systems can be used to conduct ex vivo ERG recordings from isolated mouse retinas. We combine the light stimulation, electronic and heating units of a standard in vivo system with custom-designed specimen holder, gravity-controlled perfusion system and electromagnetic noise shielding to record low-noise ex vivo ERG signals simultaneously from two retinas with the acquisition software included in commercial in vivo systems. Further, we demonstrate how to use this method in combination with pharmacological treatments that remove specific ERG components in order to dissect the function of certain retinal cell types.
Introduction
Elektroretinogram (ERG) er en veletableret teknik, der kan bruges til at optage den elektriske aktivitet i retina udløst af lys. ERG-signalet er primært genereret af spændingsændringer forårsaget af radiale strømme (langs aksen af fotoreceptorer og bipolære celler) strømmer i den resistive ekstracellulære rum af nethinden. Den første ERG signal blev indspillet i 1865 af Holmgren fra overfladen af en fisk eye 1. Einthoven og Jolly 1908 2 divideret ERG respons til udbrud af lys i tre forskellige bølger, kaldet a-, b- og c-bølger, der vides nu at afspejle hovedsagelig af aktiviteten af fotoreceptorer, ON bipolære celler og pigment epitel celler, henholdsvis 3-8. ERG kan optages fra øjnene af bedøvede dyr eller mennesker (in vivo), fra forberedelse isoleret øje 9, på tværs isoleret intakt nethinden (ex vivo) 3,10-15 eller på tværs specifikke nethinden lag med mikroelektroder (lokalERG) 4,16. Af disse in vivo ERG er i øjeblikket den mest anvendte metode til at vurdere retinal funktion. Det er en ikke-invasiv teknik, der kan anvendes til diagnostiske formål eller til at følge progressionen af retinale sygdomme hos dyr eller patienter. Dog in vivo ERG optagelser producere et kompliceret signal med flere overlappende komponenter, ofte forurenet med ekstraokulær fysiologisk støj (fx vejrtrækning og hjerteaktivitet).
Lokale ERG kan anvendes til at registrere signalet over specifikke lag af nethinden, men det er den mest invasive og har den laveste signal-til-støj-forhold (SNR) i sammenligning med de andre ERG optagelse konfigurationer. Lokale ERG er også teknisk krævende og kræver dyrt udstyr (fx mikroskop og mikromanipulatorer). Transretinal ERG fra intakte, isoleret nethinden (ex vivo ERG) tilbyder et kompromis mellem in vivo og lokale ERG metoder giver stabil og HIGh SNR optagelser fra intakte nethinder af dyr eller mennesker 17. For nylig er denne metode blevet anvendt med succes til at studere stang og kegle fotoreceptor funktion i mammale, primater og humane nethinder 18-20. Derudover, på grund af fravær af pigment epitel i ex vivo retina er den positive c-bølgekomponent af ERG signal fjernet og en fremtrædende negativ langsom PIII komponent er åbenbaret i de ex vivo optagelser. Den langsomme PIII komponent har vist sig at stamme fra aktiviteten af Müller gliaceller i nethinden 21-23. Således kunne ex vivo ERG metoden også anvendes til at studere Müller celler i ubeskadiget nethinden. Adskillige undersøgelser har også vist, at ex vivo ERG optagelser kunne bruges til at måle koncentrationen af farmakologiske midler omkring retina 24 og teste sikkerheden og effektiviteten af lægemidler 25-27.
Multiple kommerciel in vivo systemer er tilgængelige oganvendes i mange laboratorier, der ikke nødvendigvis har omfattende elektrofysiologi baggrund. I modsætning hertil har ex vivo indretninger ikke været tilgængelige indtil for nylig 17 og som et resultat kun meget få laboratorier i øjeblikket tager fordel af denne kraftfulde teknik. Det ville være en fordel at gøre ex vivo ERG optagelser til rådighed for flere laboratorier for at fremme vores viden om retinal fysiologi og patologi, og at udvikle nye behandlingsformer for blændende sygdomme. Vi demonstrerer her en enkel og prisbillig ex vivo ERG-enhed 17 og vise, hvordan den kan anvendes i kombination med flere kommercielt tilgængelige in vivo ERG systemer til registrering stang- og kegle-medieret signalering (A- og B-bølger), og funktionen af Müller celler (langsom PIII) fra intakte vildtype mus nethinder.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi demonstrerer her de kritiske trin til opnåelse af høj kvalitet ex vivo ERG optagelser samtidig fra to isolerede mus nethinder ved at bruge in vivo ERG systemkomponenter sammen med en ex vivo ERG adapter. I denne undersøgelse perfunderet vi begge nethinder fra dyret med den samme opløsning (enten Ames, Lockes eller Ringer), men det er også muligt at perfundere hver nethinden med en anden løsning fx til lægemiddel testformål. De vigtigste skridt til at opnå data af hø…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af NIH tilskud EY019312 og EY021126 (VJK), EY002687 til Department of Ophthalmology og Visual Fakultet ved Washington University og ved forskning for at forebygge blindhed.
Materials
| In vivo ERG system | OcuScience | HMsERG | www.ocuscience.us/id77.html |
| In vivo ERG system | LKC Technologies | UTAS-E 3000 | www.lkc.com/products/UTAS/bigshot.html |
| Ex vivo adapter | OcuScience | Ex VIVO ERG adapter | www.ocuscience.us/id107.html |
| Dissection microscope | North Central Instruments | Leica M80 | May use any brand |
| IR emitter | Opto Diode Corp. | OD-50L | www.optodiode.com |
| Prowler Night Vision Scopes | B.E. Meyers Electro Optics | D4300-I | Military grade product. |
| Red filter | Rosco Laboratories | Roscolux #27 Medium Red | May be used instead of IR system |
| Red head light | OcuScience | ERGX011 | www.ocuscience.us/catalog/i29.html |
| Microscissors | WPI, Inc. | 500086 | www.wpiinc.com/ |
| Dumont tweezers #5 | WPI, Inc. | 14101 | |
| Razor blades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | www.emsdiasum.com |
| Scale | Metler Toledo | AB54-S/FACT | May use any brand |
| pH meter and electrode | Beckman Coulter | pHI 350 | May use any brand |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | May use any brand |
| KCl | Sigma-Aldrich | 60129 | May use any brand |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 63020 | 1.0 M solution |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21114 | 1.0 M solution |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 431788 | May use any brand |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | May use any brand |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | May use any brand |
| Ames medium | Sigma-Aldrich | A1420 | May use any brand |
| BaCl2 | Sigma-Aldrich | B0750 | May use any brand |
| DL-AP4 | Tocris Bioscience | 101 | May use any brand |
| Succinic acid disodium salt | Sigma-Aldrich | 224731 | May use any brand |
| L-Glutamic acid | Sigma-Aldrich | G2834 | May use any brand |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | May use any brand |
| Leibovitz culture medium L-15 | Sigma-Aldrich | L4386 | May use any brand |
| MEM vitamins | Sigma-Aldrich | M6895 | |
| MEM amino acids | Sigma-Aldrich | M5550 | |
| Carbogen | Airgas | UN3156 | 5% CO2 |
Referencias
- Armington, J. C. . The Electroretinogram. , (1974).
- Einthoven, W., Jolly, W. A. The form and magnitude of the electrical response of the eye to stimulation by light at various intensities. Q J Exp Physiol. 1, 43 (1908).
- Granit, R. The components of the retinal action potential in mammals and their relation to the discharge in the optic nerve. J. Physiol. 77, 207-239 (1933).
- Penn, R. D., Hagins, W. A. Signal transmission along retinal rods and the origin of the electroretinographic a-wave. Nature. 223, 201-204 (1969).
- Stockton, R. A., Slaughter, M. M. B-wave of the electroretinogram. A reflection of ON bipolar cell activity. J. Gen. Physiol. 93, 101-122 (1989).
- Robson, J. G., Frishman, L. J. Response linearity and kinetics of the cat retina: the bipolar cell component of the dark-adapted electroretinogram. Vis. Neurosci. 12, 837-850 (1995).
- Green, D. G., Kapousta-Bruneau, N. V. A dissection of the electroretinogram from the isolated rat retina with microelectrodes and drugs. Vis. Neurosci. 16, 727-741 (1999).
- Steinberg, R. H., Schmidt, R., Brown, K. T. Intracellular responses to light from cat pigment epithelium: origin of the electroretinogram c-wave. Nature. 227, 728-730 (1970).
- Wilson, W. S., Shahidullah, M., Millar, C. The bovine arterially-perfused eye: an in vitro method for the study of drug mechanisms on IOP, aqueous humour formation and uveal vasculature. Curr. Eye Res. 12, 609-620 (1993).
- Frank, R. N., Dowling, J. E. Rhodopsin photoproducts: effects on electroretinogram sensitivity in isolated perfused rat retina. Science. 161, 487-489 (1968).
- Donner, K., Hemila, S., Koskelainen, A. Temperature-dependence of rod photoresponses from the aspartate-treated retina of the frog (Rana temporaria). Acta Physiol. Scand. 134, 535-541 (1988).
- Green, D. G., Kapousta-Bruneau, N. V. Electrophysiological properties of a new isolated rat retina preparation. Vision Res. 39, 2165-2177 (1999).
- Hamasaki, D. I. The effect of sodium ion concentration on the electroretinogram of the isolated retina of the frog. J. Physiol. 167, 156-168 (1963).
- Luke, M., et al. The isolated perfused bovine retina–a sensitive tool for pharmacological research on retinal function. Brain Res. Brain Res. Protoc. 16, 27-36 (2005).
- Bastian, B. L., Fain, G. L. Light adaptation in toad rods: requirement for an internal messenger which is not calcium. J. Physiol. 297, 493-520 (1979).
- Arden, G. B. Voltage gradients across the receptor layer of the isolated rat retina. J. Physiol. 256, 333-360 (1976).
- Vinberg, F., Kolesnikov, A. V., Kefalov, V. J. Ex vivo ERG analysis of photoreceptors using an in vivo ERG system. Vision Res. 101, 108-117 (2014).
- Nymark, S., Heikkinen, H., Haldin, C., Donner, K., Koskelainen, A. Light responses and light adaptation in rat retinal rods at different temperatures. J. Physiol. 567, 923-938 (2005).
- Heikkinen, H., Nymark, S., Koskelainen, A. Mouse cone photoresponses obtained with electroretinogram from the isolated retina. Vision Res. 48, 264-272 (2008).
- Wang, J. S., Kefalov, V. J. An alternative pathway mediates the mouse and human cone visual cycle. Curr. Biol. 19, 1665-1669 (2009).
- Bolnick, D. A., Walter, A. E., Sillman, A. J. Barium suppresses slow PIII in perfused bullfrog retina. Vision Res. 19, 1117-1119 (1979).
- Newman, E. A. Potassium conductance block by barium in amphibian Muller cells. Brain Res. 498, 308-314 (1989).
- Oakley, B., Katz, B. J., Xu, Z., Zheng, J. Spatial buffering of extracellular potassium by Muller (glial) cells in the toad retina. Exp. Eye Res. 55, 539-550 (1992).
- Nymark, S., Haldin, C., Tenhu, H., Koskelainen, A. A new method for measuring free drug concentration: retinal tissue as a biosensor. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 47, 2583-2588 (2006).
- Walter, P., Luke, C., Sickel, W. Antibiotics and light responses in superfused bovine retina. Cell. Mol. Neurobiol. 19, 87-92 (1999).
- Luke, M., et al. The safety profile of alkylphosphocholines in the model of the isolated perfused vertebrate retina. Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 248, 511-518 (2010).
- Januschowski, K., et al. Electrophysiological toxicity testing of VEGF Trap-Eye in an isolated perfused vertebrate retina organ culture model. Acta Ophthalmol. 92, e305-e311 (2014).
- Kolesnikov, A. V., Kefalov, V. J. Transretinal ERG recordings from mouse retina: rod and cone photoresponses. J Vis Exp. , (2012).
- Koskelainen, A., Hemila, S., Donner, K. Spectral sensitivities of short- and long-wavelength sensitive cone mechanisms in the frog retina. Acta Physiol. Scand. 152, 115-124 (1994).
- Lyubarsky, A. L., Falsini, B., Pennesi, M. E., Valentini, P., Pugh, E. N. UV- and midwave-sensitive cone-driven retinal responses of the mouse: a possible phenotype for coexpression of cone photopigments. J. Neurosci. 19, 442-455 (1999).
- Lyubarsky, A. L., Daniele, L. L., Pugh, E. N. From candelas to photoisomerizations in the mouse eye by rhodopsin bleaching in situ and the light-rearing dependence of the major components of the mouse ERG. Vision Res. 44, 3235-3251 (2004).
- Azevedo, A. W., Rieke, F. Experimental protocols alter phototransduction: the implications for retinal processing at visual threshold. J. Neurosci. 31, 3670-3682 (2011).
- Carter-Dawson, L. D., LaVail, M. M. Rods and cones in the mouse retina. I. Structural analysis using light and electron microscopy. J. Comp. Neurol. 188, 245-262 (1979).
- Fain, G. L., Matthews, H. R., Cornwall, M. C., Koutalos, Y. Adaptation in vertebrate photoreceptors. Physiol. Rev. 81, 117-151 (2001).
- Calvert, P. D., Strissel, K. J., Schiesser, W. E., Pugh, E. N., Arshavsky, V. Y. Light-driven translocation of signaling proteins in vertebrate photoreceptors. Trends Cell Biol. 16, 560-568 (2006).
- Schneeweis, D. M., Schnapf, J. L. The photovoltage of macaque cone photoreceptors: adaptation, noise, and kinetics. J. Neurosci. 19, 1203-1216 (1999).
- Heikkinen, H., Vinberg, F., Nymark, S., Koskelainen, A. Mesopic background lights enhance dark-adapted cone ERG flash responses in the intact mouse retina: a possible role for gap junctional decoupling. J. Neurophysiol. 105, 2309-2318 (2011).
- Gouras, P., MacKay, C. J. Growth in amplitude of the human cone electroretinogram with light adaptation. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 30, 625-630 (1989).
- Peachey, N. S., Goto, Y., al-Ubaidi, M. R., Naash, M. I. Properties of the mouse cone-mediated electroretinogram during light adaptation. Neurosci. Lett. 162, 9-11 (1993).
