Summary

Новое применение электрического проникновение график (EPG) на приобретение и измерения электрических сигналов в флоэмы сито элементов

Published: July 02, 2015
doi:

Summary

Electrical Penetration Graph (EPG) is a well-established technique for studying the feeding behavior of stylet-bearing insects. Here we show a new application of EPG as a non-invasive tool for the acquisition of intracellular electrophysiology recordings of sieve elements (SEs), the cells that form the phloem vasculature in plants.

Abstract

Электрофизиологические свойства клеток часто изучаются в пробирке, после оторвать их от родных средах. Тем не менее, исследование электрической передачи между удаленными клеток в организме требуется в естественных условиях, без артефактов записи ячеек, встроенных в их родной среде. Передачи электрических сигналов от раненых разматывать районах на заводе Уже давно пробудили интерес ботаников. Флоэмы, живой частью растения сосудистой, который распространяется по всему растению, был постулируется как основной ткани в электрической передачи в растениях. Отсутствие подходящих электрофизиологических методов создает много проблем для исследования электрических свойств клеток флоэмы в естественных условиях. Здесь мы представляем новый подход к внутриклеточной электрофизиологии сит элементов (СЭС), который использует живые тли, или другие флоэмы вскармливания hemipteran насекомых, интегрированной в электрической проникновения грател (EPG), схема. Универсальность, надежность и точность этого метода стало возможным записывать и изучать в деталях рану индуцированных электрических сигналов в МП центральных вен модель завода Arabidopsis THALIANA 1. Здесь показано, что EPG-электроды могут быть легко реализованы на внутриклеточных электрофизиологических записей СЭС в маргинальных вен, а также изучить способность реагировать МП с электрическими сигналами с несколькими внешними стимулами. Подход EPG применяется к внутриклеточной электрофизиологии МП могут быть реализованы в самых разнообразных видов растений, в большом количестве комбинаций растений / насекомых, и многие исследования направлены.

Introduction

Способность продуцировать междугородные электрические сигналы является выгодным черта многоклеточных организмов, что позволяет эффективно в ответ на внешние раздражители. Эта черта развилась независимо в растениях и животных, и, таким образом, представляет собой случай конвергентной эволюции. Учитывая, что электрические сигналы в сочетании с важных функций в организме животных, таких как нейронные передачи и сокращение мышц, молекулярной основы, механизма передачи, и функции стимул-индуцированной электрических сигналов у животных являются объектами интенсивных исследований. В отличие от этого, стимул-индуцированной электрической сигнализации в растениях получил небольшое исследование внимания. Хотя растения не имеют нервы или мышцы, там, кажется, достаточно доказательств, чтобы предположить, что стимул-индуцированной электрические сигналы в растения играют ключевую роль в их ответах на факторы окружающей среды.

Флоэмы, живой компонент растительного сосудистой, было постулировано в качестве основного субзали для передачи стимула-индуцированной электрических сигналов, из стимулированных / повреждены в нестимулированных / неповрежденные участки 2. Основные клетки в флоэмы являются сито элементы (СЭС), относительно простые, удлиненные клетки. Концы Сес подключены к другой МП, образуя непрерывный, низким сопротивлением, системы сито трубка, которая распространилась по всему растению. Есть, однако, очень мало исследований на электрических свойствах этих узкоспециализированных клеток. В этих предыдущих исследованиях, ученые обращались МП либо с стеклянные микро-электродов 3 или стеклянными электродами, которые были соединены, чтобы привить-вставленные стилеты тлей, после stylectomy (резка) 4. Стеклянные микроэлектродов изготовлены из стеклянных капилляров, что тянутся на одном конце с тепла в тонкий кончик менее 1 мкм в диаметре, а затем заполняют раствором KCl. Ag / AgCl или платиновой проволоки, вставляются в KCl-заполненной стеклянного электрода затем подключен к входу усилителя, а референтомЭлектрод вставляется в ванну окружающей клетку интерес, замыкая цепь. Эта установка записывает разность потенциалов между внеклеточной референтного электрода и внутриклеточной измерительного электрода, т.е. мембранного потенциала клетки 5. С помощью этого метода, Umrath сделал первый внутриклеточный запись из растительной клетке, с использованием водорослей Nitella 6,7. Nitella является относительно простой организм, крупных клеток, и, следовательно, поддаются внутриклеточных электрофизиологических экспериментов. В отличие от этого, введение внутриклеточных стеклянных электродов в небольших клетках многоклеточных, трехмерных наземных растений технически сложных, требует высокой квалификации исследователя, а также сложную визуализацию, микроманипуляции, и анти-вибрации оборудования. Хотя стеклянные электроды пригодны для записи из поверхностных клеток в растениях, таких как корень клеток эпидермиса 8, внутриклеточный recordinGS из клеток глубоко укоренились в ткани растения, такие как МП, повреждение индуцированных ответов очень вероятная причина, путая результаты. В 1989 году Фромм и Eschrich сообщили об использовании альтернативного метода, который называется «метод тли ', в котором стеклянные электроды, соединенный с тлей стилетами после stylectomy 4. Метод тля является минимально инвазивной, потому что гибкие стилеты не вызывают тканей или клеток повреждения также, как стеклянные электроды. Тли стилеты являются великое изобретение природы для проникновения растений и тлей значительно более опытный, чем люди в поиске МП. К сожалению, этот метод тля также весьма требовательны в плане технической экспертизы и оборудования. Кроме того, успех каждого эксперимента, который реализует этот метод полностью зависит от тли, находящегося в режиме подачи – с стилета стабильно, вставленной в SE, во время stylectomy. Думая в ретроспективе, можно увидеть, что шансы на успех этого метода можно было бы Improved путем добавления к экспериментальной установки инструмент, который позволяет идентифицировать или не тля стилет в SE при применении stylectomy.

В 1964 году, Маклин и Кинси описал "электронную систему контроля" для изучения пищевого поведения тлей в режиме реального времени 9,10. В этой системе, тля и стилет-проник растений были интегрированы в электрической цепи. Позже, в 1978 году, Tjallingii разработали модифицированную версию системы, называется "Электрические Проникновение График" (EPG) системы 11,12. В то время как оригинальный электронная система контроля был чувствителен к сопротивлению, исходящих потенциалов только с системой EPG, электродвижущая сила (ЭДС) возникла потенциалы, т.е. генерироваться на заводе или в насекомого, может быть записан в дополнение к потенциалам, вытекающих из сопротивление (R) в насекомого. Это представляет собой значительное улучшение, потому что как компоненты сигнала, ЭДС и R,обеспечить биологическую соответствующую информацию о событиях во время проникновения растений тлей. Что делает EPG предварительного усилителя чувствительны к R-компонентов является его относительно низкая входное сопротивление 1 ГОм, что близко к среднему значению сопротивления растений / тли. Небольшое напряжение смещения (Рисунок 1, V) приблизительно +100 мВ подается на заводе, который затем разделяется по растений и насекомых, с одной стороны, и входным сопротивлением, с другой стороны. Напряжения и их изменения измеряются в точке (рис 1а, б) между насекомым и входного резистора. Таким образом, R-компоненты представляют растительные тли сопротивления модуляции напряжения смещения, в то время как ЭДС-компоненты некоторая доля растений потенциалов на кончике стилета и потенциалов, вызванных в насекомое. Растительные потенциалы – наиболее значимые здесь – в основном мембранные потенциалы клеток растений проколоты тли стилетами. Насекомое потенциалы появляются, в основном,Потоковое потенциалы, вызванные движениями жидкости в течение двух стилета каналов, то есть, еда и слюнные каналы; никаких внутренних нервных или мышечных потенциалов не отражаются в EPG. На практике стилет наконечник функционирует как кончиком электрода. Все растительные клетки отрицательно заряженные внутри по отношению к положительному вне клетки. Электрический ток (т.е. движение ионов в водном растворе), вытекающих из внутренней во внешнюю и наоборот очень ограничено из-за высокой стойкости к клеточной мембране. Обычно потенциал покоя поддерживается постоянным. Однако, когда отрицательные ионы выйти или положительные ионы перемещаются через клеточную мембрану, мембранный потенциал уменьшается, т.е., это деполяризует '. Деполяризация происходит в случае возбуждения клеток. Ионы затем перейти в систему или, когда конкретные ионные каналы в мембране открываются или когда мембрана повреждена и ионы течь в и. Все клетки имеют ионные каналы и насосы в тон плазматической мембраны, которые приносят мембранный потенциал к уровню покоя, восстанавливая исходную концентрацию различных ионов внутри клетки. Потенциал покоя его изменения ЭДС компоненты, и, следовательно, метод EPG подходит для измерения их.

Фигура 1
Рисунок 1. EPG-электроды. EPG-электрод является живым тли интегрированы в электрическую Проникновение График (EPG) цепи, чьи стилет вставлен в сито элемента (СЭ) в стабильном режиме подачи. Если стилет-пронзил SE находится в состоянии покоя (панель А), напряжения в цепи, записанного EPG, является стабильным и в покоящейся потенциального уровня (Панель C, отдых). Если SE возбуждается, его мембрана деполяризует (панель B), который визуализируется в EPG, как постепенное увеличение напряжения (панель C, деполяризации). Как ионного баланса в SE возвращает отдохнуть, то есть, это repolarзует, напряжение регистрируется EPG постепенно уменьшается до отдыха потенциального уровня (Панель C, реполяризации). В панели С, "А" и "Б" относятся к сценариям, представленным на панелях А и В, соответственно. V = Регулируемый источник напряжения смещения. Ri = вход резистор. Параллельно с внешним резистором 1 ГОм, усилитель имеет внутренний (в ОУ) высокая 1.5 ТОм резистор (панели А и В, в серый). По дистанционного управления выключателем EPG предварительного усилителя может быть изменена от нормальной до ЭДС-режим, который позволяет получить очень точные значения напряжения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

В следующем разделе мы предоставляем читателю базового протокола проведения экспериментов EPG, которая действует для обоих насекомых и растений сосредоточена ориентированных исследований.

Protocol

1. тля Разведение Примечание: выбор растений и тлей видов для записей EPG зависит от научно-исследовательской целью. Для исследований на Arabidopsis THALIANA, тля капустная тля является целесообразным. Задняя Б. brassicae тли в теплице на капуста огородная. Держ…

Representative Results

В предыдущем исследовании, мы внедрили методику EPG-электрода с целью характеризующие электрические сигналы, произведенные в СЭС midvein во гусеничного атаки 1. Midvein является предпочтительным местом введения для обычных стеклянных электродов, а также для стекла стилета электродов, п?…

Discussion

Эта статья предусматривает подробный протокол для создания электрического Проникновение график (EPG) записей. Техника EPG хорошо известна, с 100-200 активных пользователей по всему миру, и это было осуществлено в течение многих исследований по различным темам, например:) Сопротивление расте…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

VSR была поддержана IIF Мари Кюри Грант (ранение в землю, акроним для: Рана индуцированных электрических сигналов в Arabidopsis THALIANA).

Materials

Brass connector pins EPG Systems/hardw.shop Φ 1.2 mm
Thin copper wire EPG Systems/hardw.shop approx. Φ 0.2 mm
Thin gold wire EPG Systems Φ 18 µm
Soldering fluid hardware shop matching the soldering wire
Resin-cored soldering wire hardware shop
Styrofoam any
Water-based silver glue EPG systems recipe in: www.epgsystems.eu
Paper wipes Kimberly-Clark 5511
Soldering bolt any
Stereomicroscope Hund Wetzlar minimum magnification is x10
Small scissors Fine Science Tools 14088-10
Scalpel Fine Science Tools 10050-00
Fine forceps Fine Science Tools 11231-20
Vortex A. Hartenstein L46
Watercolor brushes any Number 1 or 2
Air suction device see description in: www.epgsystems.eu
Insect pins any No. 1 or 2
Solid table
Faraday cage Hand made
Computer Fujitsu Siemens
Data acquisition software EPG Systems Stylet+d
Giga-4 (-8) Complete System EPG Systems
includes the following:
Main control box with USB output Di155/Di710 12/14 bit, rate 100Hz(softw. fixed)
EPG probes 4 (8) 50x DC pre-amplifier
Swivel clamps on rod
DC power adaptor bipolar, 230/115 VAC to -/+8 VDC
Plant electrodes and cables
Additional test and ground cables 

Referencias

  1. Salvador-Recatalà, V., Tjallingii, W. F., Farmer, E. E. Real-time, in vivo. intracellular recordings of caterpillar-induced depolarization waves in sieve elements using aphid electrodes. New Phytologist. 203 (2), 674-684 (2014).
  2. Van Bel, A. J., Knoblauch, M., Furch, A. C., Hafke, J. B. (Questions)n on phloem biology. 1. Electropotential waves, Ca2+ fluxes and cellular cascades along the propagation pathway. Plant Science. 181 (3), 210-218 (2011).
  3. Rhodes, J. D., Thain, J. F., Wildon, D. C. The pathway for electrical signal conduction in the wounded tomato plant. Planta. 200, 50-57 (1996).
  4. Fromm, J., Eschrich, W. Correlation of ionic movements with phloem unloading and loading in barley leaves. Plant Physiology and Biochemistry. 27, 577-585 (1989).
  5. Brette, R., Destexhe, A., Brette, R., Destexhe, A. Intracellular Recordings. Handbook of Neural Activity Measurement. , 44-91 (2012).
  6. Umrath, K. Untersuchungen über Plasma und Plasamstromung an Characeen. IV. Potentialmessungen an Nitella mucronata. mit besonderer Berücksichtingung der Erregungserscheinungen. Protoplasma. 9, 576-597 (1930).
  7. Umrath, K. Der Erregungsvorgang bei Nitella mucronata. Protoplasma. 17, 258-300 (1932).
  8. Carden, D. E., Walker, D. J., Flowers, T. J., Miller, A. J. Single-cell measurements of the contribution of cytosolic Na+ and K+ to salt tolerance. Plant Physiology. 131 (2), 676-683 (2003).
  9. Miles, P. W., McLean, D. L., Kinsey, M. G. Evidence that two species of aphid ingest food through an open stylet sheath. Experientia. 20 (10), 582 (1964).
  10. McLean, D. L., Kinsey, M. G. A technique for electronically recording aphid feeding and salivation. Nature. 202, 1358-1359 (1965).
  11. Tjallingii, W. F. Electronic recording of penetration behaviour by aphids. Entomologia Experimentalis et Applicata. 24, 721-730 (1978).
  12. Tjallingii, W. F. Membrane potentials as an indication for plant cell penetration by aphid stylets. Entomologia Experimentalis et Applicata. 38, 187-193 (1985).
  13. Alvarez, E. E., et al. Comparative analysis of Solanum stoloniferum. responses to probing by the green peach aphid Myzus persicae. and the potato aphid Macrosiphum euphorbiae. Insect Science. 20 (2), 207-227 (2013).
  14. Carmo-Sousa, M., Moreno, A., Garzo, E., Fereres, A. A non-persistently transmitted virus induces a pull-push strategy in its aphid vector to optimize transmission and spread. Virus Research. 186, 38-46 (2014).
  15. Jacobson, A. L., Kennedy, G. G. Electrical Penetration Graph studies to investigate the effects of cyantraniliprole on feeding behavior of Myzus persicae. (Hemiptera: Aphididae) on Capsicum annuum. Pest Management Science. 70 (5), 836-840 (2014).
  16. Morris, G., Foster, W. A. Duelling aphids: electrical penetration graphs reveal the value of fighting for a feeding site. Journal of Experimental Biology. 211 (9), 1490-1494 (2008).

Play Video

Citar este artículo
Salvador-Recatalà, V., Tjallingii, W. F. A New Application of the Electrical Penetration Graph (EPG) for Acquiring and Measuring Electrical Signals in Phloem Sieve Elements. J. Vis. Exp. (101), e52826, doi:10.3791/52826 (2015).

View Video