Una nueva aplicación de la eléctrica Penetración Gráfico (EPG) para la adquisición y medición de señales eléctricas en el floema Tamiz Elementos

La capacidad de producir señales eléctricas de larga distancia es un rasgo ventajoso de los organismos multicelulares que permite respuestas eficientes a los estímulos externos. Este rasgo ha evolucionado independientemente en plantas y animales, y por lo tanto representa un caso de evolución convergente. Dado que las señales eléctricas se acoplan con funciones importantes en animales tales como la transmisión neural y la contracción muscular, la base molecular, el mecanismo de transmisión, y la función de señales eléctricas estímulos inducidos en animales son sujetos de investigación intensiva. Por el contrario, los estímulos inducidos por la señalización eléctrica en plantas ha recibido poca atención de la investigación. Aunque las plantas no tienen nervios o músculos, parece que hay suficiente evidencia para suponer que las señales eléctricas estímulos inducidos en las plantas juegan un papel clave en sus respuestas a los factores ambientales.

El floema, el componente viviente de la vasculatura de la planta, se ha postulado como un sub importanteStrate para la transmisión de señales eléctricas estímulos inducidos, desde estimulado / dañado a las áreas no estimulados / ² no dañadas. Las principales células del floema son los elementos de criba (SES), células relativamente simple, alargados. Los extremos de las PE están conectados a otra SE, formando una baja resistencia continua, sistema de tubos de tamiz que se extendió por toda la planta. Hay, sin embargo, muy pocos estudios sobre las propiedades eléctricas de estas células altamente especializadas. En estos estudios anteriores, los investigadores acceder a las PE, ya sea con vidrio micro-electrodos ³ estiletes o con electrodos de vidrio que fueron acoplados a plantar insertados-de áfidos, después stylectomy (corte) ^4. Microelectrodos de vidrio están hechos de capilares de vidrio que se extraen en un extremo con calor en una punta fina de menos de 1 micra de diámetro, y luego se llena con una solución de KCl. A Ag / AgCl o platino alambre, se inserta en el electrodo de vidrio llenos de KCl se conecta entonces a la entrada del amplificador, y un referenteelectrodo se inserta en el baño que rodea a la célula de interés, completando el circuito. Esta configuración registra la diferencia de potencial entre el electrodo extracelular referente y el electrodo de medición intracelular, es decir, el potencial de membrana de la célula ^5. Con este método, Umrath hizo la primera grabación intracelular de una célula de planta, utilizando las algas Nitella ^6,7. Nitella es un organismo relativamente simple con células grandes, y por lo tanto susceptibles de experimentos de electrofisiología intracelulares. En contraste, la inserción de electrodos de vidrio intracelulares en las pequeñas células de plantas terrestres multi-celulares, tridimensionales es técnicamente exigente, requiere un investigador altamente cualificado, así como la visualización sofisticado, micromanipulación, y equipo anti-vibración. Aunque electrodos de vidrio son adecuados para grabar a partir de células superficiales en plantas, tales como células epidérmicas de la raíz ^8, recordin intracelulargs de células profundamente arraigados en el tejido de la planta, tales como las SE, las respuestas inducidas por daños por causas muy probables, confundiendo los resultados. En 1989, Fromm y Eschrich informaron el uso de un método alternativo, llamado el "método pulgón ', en la que los electrodos de vidrio se acoplan a estiletes áfidos después stylectomy ^4. El método áfido es mínimamente invasivo, porque estiletes flexibles no causan daño tejido o célula como electrodos de vidrio hacen. Estiletes áfidos son gran invento de la naturaleza para la penetración de la planta, y los áfidos son considerablemente más hábiles que los seres humanos en la búsqueda de la SE. Desafortunadamente, este método pulgón también es muy exigente en términos de experiencia y el equipo técnico. Además, el éxito de cada experimento que implementa esta técnica depende enteramente de la áfido estar en modo de alimentación – con el estilete insertado en una forma estable SE, en el momento de stylectomy. Pensando en retrospectiva, uno puede ver que las probabilidades de éxito de esta técnica podría haber sido improved mediante la adición a la configuración experimental de un instrumento que permite identificar si o no el estilete áfido está en el SE al aplicar stylectomy.

En 1964, McLean y Kinsey describen un "sistema de vigilancia electrónica" para el estudio del comportamiento de alimentación de los pulgones en tiempo real ^9,10. En este sistema, el pulgón y la planta estilete-penetrado fueron integrados en un circuito eléctrico. Más tarde, en 1978, Tjallingii ideó una versión modificada del sistema, llamado sistema 'eléctrico Penetración Graph' (EPG) ^11,12. Considerando que el sistema de monitorización electrónica original era sensible a los potenciales de resistencia originada solamente, con el sistema EPG, la fuerza electromotriz (fem) se originó potenciales, es decir, generados en la planta o en el insecto, se podrían registrar además de los potenciales derivados de la resistencia (R) en el insecto. Esto representa una mejora importante, debido a que tanto la señal de componentes, fem y R,proporcionar biológica información pertinente sobre los acontecimientos durante la penetración planta por áfidos. Lo que hace que el preamplificador EPG sensibles a los componentes R es su relativamente baja resistencia de entrada de 1 GΩ, que es cerca de la media de la resistencia de la planta / pulgón. Una tensión de offset pequeño (Figura 1, V) de aproximadamente 100 mV se aplica a la planta, que luego se divide a través de plantas e insectos en un lado, y la resistencia de entrada en el otro. Las tensiones y sus cambios se miden en un punto (Figura 1A, B) entre el insecto y la resistencia de entrada. Por lo tanto, los componentes R representan modulaciones de resistencia-áfido de plantas de la tensión de offset, mientras que los componentes son emf una cierta fracción de los potenciales de la planta en la punta del estilete y potenciales causados ​​en el insecto. Los potenciales de plantas – más relevantes aquí – son potenciales principalmente de membrana de las células vegetales pinchados por los estiletes de áfidos. Los potenciales de insectos parecen ser principalmentelos potenciales de transmisión causados ​​por los movimientos de fluidos dentro de los dos canales del estilete, es decir, la comida y los canales salivales; no hay potenciales de los nervios o músculos internos se registran en la EPG. En la práctica, las funciones de la punta del estilete como una punta de electrodo. Todas las células vegetales están cargados negativamente en el interior respecto al exterior positivo de la célula. La corriente eléctrica (es decir, el movimiento de iones cargados en solución acuosa) que fluye desde el interior hacia el exterior y vice versa es muy limitada debido a la alta resistencia de la membrana celular. Normalmente, el potencial de reposo se mantiene constante. Sin embargo, cuando los iones negativos se mueven hacia fuera o iones positivos se mueven a través de la membrana celular, el potencial de membrana se reduce, es decir, es despolariza '. La despolarización se produce en el caso de la excitación celular. Los iones entonces se mueven dentro o fuera cuando los canales de iones específicos en la membrana se abren o cuando la membrana está dañada y los iones de fugas dentro y fuera. Todas las células tienen canales iónicos y bombas en tque la membrana plasmática que llevar el potencial de membrana a su nivel de reposo mediante la restauración de la concentración original de diversos iones dentro de la célula. El potencial de reposo y sus cambios son componentes emf, y por lo tanto, la técnica de EPG es adecuado para medir ellos.

Figura 1. EPG-electrodos. La EPG-electrodo es un áfido de estar integrado en el circuito eléctrico Penetración Graph (EPG), cuyo estilete se inserta en un elemento de tamiz (SE) en el modo de alimentación estable. Si el estilete SE-empalado está en reposo (panel A), el voltaje en el circuito, registrado por EPG, es estable y en el nivel de potencial de reposo (Panel C, Rest). Si la SE es excitado, sus despolariza la membrana (panel B), que se visualiza en la EPG como un incremento gradual en el voltaje (panel C, despolarización). Como el equilibrio iónico en la SE vuelve a descansar, es decir, repolarizes, la tensión registrada por EPG disminuye gradualmente al nivel potencial de reposo (Grupo C, repolarización). En el panel C, "A" y "B" se refieren a los escenarios que se muestran en los paneles A y B, respectivamente. V = Ajustable fuente de tensión de offset. Ri = resistencia de entrada. En paralelo a la resistencia externa 1 GΩ, el amplificador tiene una interna (en el OpAmp) de alta resistencia de 1,5 TΩ (paneles A y B, en gris). Por control remoto del interruptor de la pre-amplificador EPG se puede cambiar de normal a EMF-mode, que permite obtener valores de tensión de alta precisión. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

En la siguiente sección, ofrecemos al lector con un protocolo básico para la realización de experimentos de EPG que es válido tanto para los estudios de insectos centrado y enfocado en plantas.